304 nerūsējošā tērauda spoles caurules ķīmiskais komponents, SPACA6 ektodomēna struktūra satur konservētu proteīnu virsģimeni, kas saistīta ar gametu saplūšanu.

Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Turklāt, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs rādām vietni bez stiliem un JavaScript.
Slīdņi, kas parāda trīs rakstus katrā slaidā.Izmantojiet pogas Atpakaļ un Nākamais, lai pārvietotos pa slaidiem, vai slaidu kontrollera pogas beigās, lai pārvietotos pa katru slaidu.

SPACA6 ir spermas ekspresēts virsmas proteīns, kas ir ļoti svarīgs gametu saplūšanai zīdītāju seksuālās reprodukcijas laikā.Neskatoties uz šo fundamentālo lomu, SPACA6 īpašā funkcija ir slikti izprotama.Mēs noskaidrojam SPACA6 ekstracelulārā domēna kristāla struktūru ar izšķirtspēju 2, 2 Å, atklājot divu domēnu proteīnu, kas sastāv no četrpavedienu saišķa un Ig līdzīgām β-sviestmaizēm, kas savienotas ar gandrīz elastīgiem linkeriem.Šī struktūra atgādina IZUMO1, citu ar gametu saplūšanu saistītu proteīnu, padarot SPACA6 un IZUMO1 ar apaugļošanu saistīto proteīnu virsģimenes dibinātājus, kas šeit minēti kā IST virsģimene.IST virsģimeni strukturāli nosaka tās savītais četru spirāles saišķis un ar disulfīdu saistītu CXXC motīvu pāris.Uz struktūru balstīta cilvēka proteoma AlphaFold meklēšana atklāja papildu šīs virsģimenes proteīnu locekļus;jo īpaši daudzi no šiem proteīniem ir iesaistīti gametu saplūšanā.SPACA6 struktūra un tās attiecības ar citiem IST virsģimenes locekļiem nodrošina trūkstošo saiti mūsu zināšanās par zīdītāju gametu saplūšanu.
Katra cilvēka dzīve sākas ar divām atsevišķām haploīdām gametām: tēva spermu un mātes olšūnu.Šī sperma ir uzvarējusi intensīvā atlases procesā, kura laikā miljoniem spermatozoīdu iziet cauri sieviešu dzimumorgāniem, pārvar dažādus šķēršļus1 un tiek pakļauti kapacitātei, kas uzlabo to kustīgumu un virsmas komponentu procesu2,3,4.Pat ja spermatozoīdi un oocīti atrod viens otru, process vēl nav beidzies.Ocītu ieskauj kumuliņu šūnu slānis un glikoproteīna barjera, ko sauc par zona pellucida, caur kuru spermai ir jāiziet, lai iekļūtu oocītā.Spermatozoīdi izmanto virsmas adhēzijas molekulu un ar membrānu saistītu un izdalīto enzīmu kombināciju, lai pārvarētu šīs galīgās barjeras5.Šīs molekulas un fermenti galvenokārt tiek glabāti iekšējā membrānā un akrosomu matricā un tiek atklāti, kad akrosomu reakcijas laikā tiek lizēta spermas ārējā membrāna6.Pēdējais solis šajā intensīvajā ceļojumā ir spermas un olu saplūšanas notikums, kurā abas šūnas sapludina savas membrānas, lai kļūtu par vienu diploīdu organismu7.Lai gan šis process ir revolucionārs cilvēka reprodukcijā, nepieciešamā molekulārā mijiedarbība ir slikti izprotama.
Papildus gametu apaugļošanai ir plaši pētīta divu lipīdu divslāņu saplūšanas ķīmija.Kopumā membrānu saplūšana ir enerģētiski nelabvēlīgs process, kurā olbaltumvielu katalizatoram ir jāveic strukturālas konformācijas izmaiņas, kas tuvina divas membrānas, pārtraucot to nepārtrauktību un izraisot saplūšanu8, 9.Šie proteīnu katalizatori ir pazīstami kā fuzogēni un ir atrasti neskaitāmās saplūšanas sistēmās.Tie ir nepieciešami vīrusa iekļūšanai saimniekšūnās (piem., gp160 HIV-1, smaile koronavīrusos, hemaglutinīns gripas vīrusos) 10, 11, 12 placentas (sincitīns)13, 14, 15 un gametu veidojošai saplūšanai zemākajos eikariotos ( HAP2/GCS1 augos, protistos un posmkājos) 16,17,18,19.Cilvēka gametu fusogēni vēl nav atklāti, lai gan ir pierādīts, ka vairāki proteīni ir kritiski svarīgi gametu piesaistei un saplūšanai.Ocītos ekspresētais CD9, transmembrānas proteīns, kas nepieciešams peles un cilvēka gametu saplūšanai, bija pirmais, kas tika atklāts 21, 22, 23.Lai gan tā precīza funkcija joprojām nav skaidra, šķiet, ka loma adhēzijā, adhēzijas perēkļu struktūra uz olu mikrovillītēm un / vai pareiza olšūnu virsmas proteīnu lokalizācija šķiet iespējama 24, 25, 26.Divi tipiskākie proteīni, kas ir kritiski gametu saplūšanai, ir spermas proteīns IZUMO127 un oocītu proteīns JUNO28, un to savstarpējā saistība ir svarīgs solis gametu atpazīšanā un adhēzijā pirms saplūšanas.Izumo1 nokautu peļu tēviņi un Juno nokautu peļu mātītes ir pilnīgi sterilas, šajos modeļos spermatozoīdi nonāk perivitelīna telpā, bet gametas nesaplūst.Līdzīgi saplūšana tika samazināta, ja cilvēka in vitro apaugļošanas eksperimentos gametas tika apstrādātas ar anti-IZUMO1 vai JUNO27,29 antivielām.
Nesen tika atklāta jaunatklāta spermas ekspresētu proteīnu grupa, kas fenotipiski līdzīga IZUMO1 un JUNO20,30,31,32,33,34,35.Liela mēroga peļu mutaģenēzes pētījumā spermas akrosomu membrānas saistītais proteīns 6 (SPACA6) ir identificēts kā būtisks apaugļošanai.Transgēna ievietošana Spaca6 gēnā rada nekausējamus spermatozoīdus, lai gan šie spermatozoīdi iefiltrējas perivitelīna telpā36.Turpmākie izslēgšanas pētījumi ar pelēm apstiprināja, ka Gametu saplūšanai ir nepieciešams Spaca630,32.SPACA6 tiek ekspresēts gandrīz tikai sēkliniekos, un tā lokalizācijas modelis ir līdzīgs IZUMO1, proti, spermatozoīdu intimā pirms akrosomālās reakcijas, un pēc tam migrē uz ekvatoriālo reģionu pēc akrosomu reakcijas 30, 32.Spaca6 homologi pastāv dažādos zīdītajos un citos eikariotos 30 , un to nozīme cilvēka gametu saplūšanā ir pierādīta, inhibējot cilvēka apaugļošanu in vitro ar rezistenci pret SPACA6 30 .Atšķirībā no IZUMO1 un JUNO, SPACA6 struktūras, mijiedarbības un funkcijas detaļas joprojām nav skaidras.
Lai labāk izprastu fundamentālo procesu, kas ir cilvēka spermas un olšūnu saplūšanas pamatā, kas ļaus mums informēt par turpmāko attīstību ģimenes plānošanā un auglības ārstēšanā, mēs veicām SPACA6 strukturālos un bioķīmiskos pētījumus.SPACA6 ekstracelulārā domēna kristāliskā struktūra parāda četru spirālveida saišķi (4HB) un imūnglobulīnam līdzīgu (Ig līdzīgu) domēnu, kas savienoti ar gandrīz elastīgiem reģioniem.Kā prognozēts iepriekšējos pētījumos 7, 32, 37, SPACA6 domēna struktūra ir līdzīga cilvēka IZUMO1 struktūrai, un abiem proteīniem ir neparasts motīvs: 4HB ar trīsstūrveida spirālveida virsmu un pāris ar disulfīdu saistītu CXXC motīvu.Mēs ierosinām, ka IZUMO1 un SPACA6 tagad definē lielāku, strukturāli saistītu proteīnu virsģimeni, kas saistīta ar gametu saplūšanu.Izmantojot funkcijas, kas raksturīgas tikai virsģimenei, mēs veicām izsmeļošu AlphaFold strukturālā cilvēka proteoma meklēšanu, identificējot papildu šīs virsģimenes locekļus, tostarp vairākus locekļus, kas iesaistīti gametu saplūšanā un/vai apaugļošanā.Tagad šķiet, ka ar gametu saplūšanu ir saistīta kopēja strukturāla kroka un proteīnu virsģimene, un mūsu struktūra nodrošina šī svarīgā cilvēka gametu saplūšanas mehānisma aspekta molekulāro karti.
SPACA6 ir vienas caurlaides transmembrānas proteīns ar vienu N-saistītu glikānu un sešām iespējamām disulfīda saitēm (S1a un S2 attēls).Mēs izteicām ārpusšūnu domēnu cilvēka SPACA6 (atlikumi 27-246) Drosophila S2 šūnās un attīrīts proteīns, izmantojot niķeļa afinitāti, katjonu apmaiņu un izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju (S1b att.).Attīrītais SPACA6 ektodomēns ir ļoti stabils un viendabīgs.Analīze, izmantojot izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju apvienojumā ar daudzstūra gaismas izkliedi (SEC-MALS), atklāja vienu maksimumu ar aprēķināto molekulmasu 26,2 ± 0,5 kDa (S1c att.).Tas atbilst SPACA6 monomēra ektodomēna lielumam, norādot, ka attīrīšanas laikā oligomerizācija nenotika.Turklāt cirkulārā dihroisma (CD) spektroskopija atklāja jauktu α/β struktūru ar kušanas temperatūru 51,3 °C (S1d, e att.).CD spektru dekonvolācija atklāja 38,6% α-spirālveida un 15,8% β-pavedienu elementu (S1d attēls).
SPACA6 ektodomēns tika kristalizēts, izmantojot nejaušu matricas iesēšanu38, kā rezultātā tika iegūta datu kopa ar izšķirtspēju 2, 2 Å (1. tabula un S3 attēls).Struktūras noteikšanai izmantojot uz fragmentiem balstītas molekulārās aizstāšanas un SAD fāzes datu kombināciju ar bromīda iedarbību (1. tabula un S4 attēls), galīgais pilnveidotais modelis sastāv no 27.–246. atlikumiem.Struktūras noteikšanas laikā nebija pieejamas eksperimentālas vai AlphaFold struktūras.SPACA6 ektodomēna izmēri ir 20 Å × 20 Å × 85 Å, tas sastāv no septiņām spirālēm un deviņām β-virknēm, un tam ir iegarena terciārā kroka, ko stabilizē sešas disulfīda saites (1.a, b att.).Vājš elektronu blīvums Asn243 sānu ķēdes galā norāda, ka šis atlikums ir ar N-saistīta glikozilācija.Struktūra sastāv no diviem domēniem: N-termināla četru spirāles saišķa (4HB) un C-termināla Ig līdzīga domēna ar starpposma viras apgabalu starp tiem (1.c att.).
SPACA6 ekstracelulārā domēna struktūra.SPACA6 ekstracelulārā domēna sloksnes diagramma, ķēdes krāsa no N līdz C-galam no tumši zilas līdz tumši sarkanai.Cisteīni, kas iesaistīti disulfīda saitēs, ir izcelti purpursarkanā krāsā.b SPACA6 ekstracelulārā domēna topoloģija.Izmantojiet to pašu krāsu shēmu kā 1.a attēlā.c SPACA6 ārpusšūnu domēns.4HB, eņģes un Ig līdzīgas domēna lentes diagrammas ir attiecīgi oranžas, zaļas un zilas.Slāņi nav zīmēti mērogā.
SPACA6 4HB domēns ietver četras galvenās spirāles (spirāles 1–4), kuras ir izkārtotas spirālveida spirāles formā (2.a att.), mijas starp antiparalēlām un paralēlām mijiedarbībām (2.b att.).Neliela papildu viena pagrieziena spirāle (spirāle 1′) ir novietota perpendikulāri saišķim, veidojot trijstūri ar spirālēm 1 un 2. Šis trijstūris ir nedaudz deformēts spirālveidīgi savītajā spirālveida 3. un 4. relatīvi blīvā blīvējuma iepakojumā ( 2.a att.).
4HB N-termināla lentes diagramma.b Skats no augšas uz četru spirāļu saišķi, katra spirāle ir izcelta tumši zilā krāsā N-galā un tumši sarkanā krāsā C-galā.c No augšas uz leju spirālveida riteņa diagramma 4HB, kur katrs atlikums parādīts kā aplis, kas marķēts ar viena burta aminoskābes kodu;ir numurētas tikai četras aminoskābes, kas atrodas riteņa augšpusē.Nepolārie atlikumi ir iekrāsoti dzeltenā krāsā, polārie neuzlādētie atlikumi ir iekrāsoti zaļā krāsā, pozitīvi lādētie atlikumi ir iekrāsoti zilā krāsā, bet negatīvi lādētie atlikumi ir sarkanā krāsā.d 4HB domēna trīsstūrveida virsmas ar 4HB oranžā krāsā un eņģēm zaļā krāsā.Abos ieliktņos ir redzamas stieņa formas disulfīda saites.
4HB ir koncentrēts uz iekšējā hidrofobā kodola, kas sastāv galvenokārt no alifātiskām un aromātiskām atliekām (2.c attēls).Kodols satur disulfīda saiti starp Cys41 un Cys55, kas savieno spirāles 1 un 2 kopā augšējā, izvirzītā trīsstūrī (2.d attēls).Divas papildu disulfīda saites tika izveidotas starp CXXC motīvu Helix 1′ un citu CXXC motīvu, kas atrasts β-matadatas galā eņģes reģionā (2.d attēls).Konservatīvs arginīna atlikums ar nezināmu funkciju (Arg37) atrodas dobā trīsstūrī, ko veido spirāles 1′, 1 un 2. Alifātiskie oglekļa atomi Cβ, Cγ un Cδ Arg37 mijiedarbojas ar hidrofobo kodolu, un tā guanidīna grupas cikliski pārvietojas. starp spirālēm 1′ un 1, izmantojot mijiedarbību starp Thr32 mugurkaulu un sānu ķēdi (S5a, b att.).Tyr34 iestiepjas dobumā, atstājot divus mazus dobumus, caur kuriem Arg37 var mijiedarboties ar šķīdinātāju.
Ig līdzīgie β-sviestmaižu domēni ir liela proteīnu virsģimene, kam ir kopīga iezīme – divas vai vairākas daudzpavedienu amfipātiskas β loksnes, kas mijiedarbojas caur hidrofobu kodolu 39. SPACA6 C-gala Ig līdzīgajam domēnam ir tāds pats modelis. un sastāv no diviem slāņiem (S6a att.).1. lapa ir β-loksne no četriem pavedieniem (virzieni D, F, H un I), kur virknes F, H un I veido antiparalēlu izkārtojumu, un I un D pavedieni mijiedarbojas paralēli.2. tabula ir neliela pretparalēla divpavedienu beta lapa (virzieni E un G).Starp E ķēdes C-galu un H ķēdes centru (Cys170-Cys226) tika novērota iekšējā disulfīda saite (S6b att.).Šī disulfīda saite ir analoga disulfīda saitei imūnglobulīna β-sendviča domēnā40,41.
Četru pavedienu β-loksne griežas visā garumā, veidojot asimetriskas malas, kas atšķiras pēc formas un elektrostatikas.Plānākā mala ir plakana hidrofoba vides virsma, kas izceļas salīdzinājumā ar atlikušajām nelīdzenajām un elektrostatiski daudzveidīgajām virsmām SPACA6 (S6b, c att.).Atklātu mugurkaula karbonil/aminogrupu un polāro sānu ķēžu halo ieskauj hidrofobo virsmu (S6c att.).Plašāka robeža ir pārklāta ar ierobežotu spirālveida segmentu, kas bloķē hidrofobā kodola N-gala daļu un veido trīs ūdeņraža saites ar F ķēdes mugurkaula atvērto polāro grupu (S6d att.).Šīs malas C-gala daļa veido lielu kabatu ar daļēji atklātu hidrofobu kodolu.Kabatu ieskauj pozitīvi lādiņi, ko izraisa trīs dubulto arginīna atlieku komplekti (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 un Arg212-Arg214) un centrālais histidīns (His220) (S6e attēls).
Eņģes reģions ir īss segments starp spirālveida domēnu un Ig līdzīgu domēnu, kas sastāv no viena antiparalēla trīspavedienu β slāņa (virknes A, B un C), nelielas 310 spirāles un vairākiem gariem nejaušiem spirālveida segmentiem.(S7 att.).Šķiet, ka kovalento un elektrostatisko kontaktu tīkls eņģes reģionā stabilizē orientāciju starp 4HB un Ig līdzīgu domēnu.Tīklu var iedalīt trīs daļās.Pirmajā daļā ir iekļauti divi CXXC motīvi (27CXXC30 un 139CXXC142), kas veido disulfīda saišu pāri starp β-matadatu eņģē un 1′ spirāli 4HB.Otrajā daļā ir iekļauta elektrostatiskā mijiedarbība starp Ig līdzīgu domēnu un viru.Glu132 eņģē veido sāls tiltu ar Arg233 Ig līdzīgajā domēnā un Arg135 eņģē.Trešā daļa ietver kovalento saiti starp Ig līdzīgu domēnu un eņģes reģionu.Divas disulfīda saites (Cys124-Cys147 un Cys128-Cys153) savieno eņģes cilpu ar saiti, ko stabilizē elektrostatiskā mijiedarbība starp Gln131 un mugurkaula funkcionālo grupu, ļaujot piekļūt pirmajam Ig līdzīgajam domēnam.ķēde.
SPACA6 ektodomēna struktūra un atsevišķas 4HB un Ig līdzīgu domēnu struktūras tika izmantotas, lai proteīnu datubāzēs meklētu strukturāli līdzīgus ierakstus 42 .Mēs identificējām atbilstības ar augstiem Dali Z rādītājiem, nelielām standarta novirzēm un lieliem LALI rādītājiem (pēdējais ir strukturāli līdzvērtīgu atlikumu skaits).Lai gan pirmajiem 10 trāpījumiem no pilnas ektodomēna meklēšanas (S1 tabula) bija pieņemams Z rezultāts >842, tikai 4HB vai Ig līdzīga domēna meklēšana parādīja, ka lielākā daļa šo trāpījumu atbilst tikai β-sviestmaizēm.visuresoša kroka, kas atrodama daudzos proteīnos.Visi trīs meklējumi Dalī sniedza tikai vienu rezultātu: IZUMO1.
Jau sen ir ierosināts, ka SPACA6 un IZUMO1 ir strukturālas līdzības 7, 32, 37.Lai gan šo divu ar gametu saplūšanu saistīto proteīnu ektodomēniem ir tikai 21% sekvences identitāte (S8a attēls), sarežģīti pierādījumi, tostarp konservēts disulfīda saites modelis un paredzamais C-termināla Ig līdzīgais domēns SPACA6, ļāva agrīni mēģināt izveidot A SPACA6 peles homoloģijas modelis, izmantojot IZUMO1 kā veidni37.Mūsu struktūra apstiprina šīs prognozes un parāda patieso līdzības pakāpi.Faktiski SPACA6 un IZUMO137, 43, 44 struktūrām ir viena un tā pati divu domēnu arhitektūra (S8b att.) ar līdzīgiem 4HB un Ig līdzīgiem β-sendviča domēniem, kas savienoti ar viras reģionu (S8c att.).
IZUMO1 un SPACA6 4HB ir kopīgas atšķirības no parastajiem spirālveida saišķiem.Tipiskiem 4HB, piemēram, tiem, kas atrodami SNARE proteīnu kompleksos, kas iesaistīti endosomu saplūšanā 45, 46, ir vienmērīgi izvietotas spirāles, saglabājot nemainīgu izliekumu ap centrālo asi 47. Turpretim spirālveida domēni gan IZUMO1, gan SPACA6 bija izkropļoti ar mainīgu izliekumu un nevienmērīgs iepakojums (S8d attēls).Pagrieziens, ko, iespējams, izraisa trijstūris, ko veido spirāles 1′, 1 un 2, tiek saglabāts IZUMO1 un SPACA6 un stabilizēts ar to pašu CXXC motīvu uz spirāles 1′.Tomēr papildu disulfīda saite, kas atrodama SPACA6 (Cys41 un Cys55, kas kovalenti savieno spirāles 1 un 2 iepriekš), rada asāku virsotni trijstūra virsotnē, padarot SPACA6 vairāk savīti nekā IZUMO1, ar izteiktākiem dobuma trīsstūriem.Turklāt IZUMO1 trūkst Arg37, kas novērots šī SPACA6 dobuma centrā.Turpretim IZUMO1 ir tipiskāks alifātisko un aromātisko atlikumu hidrofobs kodols.
IZUMO1 ir Ig līdzīgs domēns, kas sastāv no divpavedienu un piecpavedienu β-loksnes43.Papildu virkne IZUMO1 aizvieto SPACA6 spoli, kas mijiedarbojas ar F virkni, lai ierobežotu mugurkaula ūdeņraža saites.Interesants salīdzinājuma punkts ir paredzamais divu proteīnu Ig līdzīgu domēnu virsmas lādiņš.IZUMO1 virsma ir negatīvāk lādēta nekā SPACA6 virsma.Papildu lādiņš atrodas netālu no C-gala, kas vērsts pret spermas membrānu.SPACA6 tie paši reģioni bija neitrālāki vai pozitīvi uzlādēti (S8e att.).Piemēram, SPACA6 hidrofobā virsma (plānākas malas) un pozitīvi lādētas bedres (plašākas malas) ir negatīvi uzlādētas IZUMO1.
Lai gan attiecības un sekundārās struktūras elementi starp IZUMO1 un SPACA6 ir labi saglabājušies, Ig līdzīgu domēnu strukturālā saskaņošana parādīja, ka abi domēni atšķiras savā vispārējā orientācijā viens pret otru (S9 att.).IZUMO1 spirālveida saišķis ir izliekts ap β-sviestmaizi, veidojot iepriekš aprakstīto “bumeranga” formu aptuveni 50° leņķī no centrālās ass.Turpretī SPACA6 spirālveida stars tika sasvērts par aptuveni 10 ° pretējā virzienā.Atšķirības šajās orientācijās, iespējams, ir saistītas ar atšķirībām eņģes reģionā.Primārās secības līmenī IZUMO1 un SPACA6 ir neliela secību līdzība pie eņģes, izņemot cisteīna, glicīna un asparagīnskābes atlikumus.Rezultātā ūdeņraža saites un elektrostatiskie tīkli ir pilnīgi atšķirīgi.β-loksnes sekundārās struktūras elementus koplieto IZUMO1 un SPACA6, lai gan ķēdes IZUMO1 ir daudz garākas un 310 spirāle (5. spirāle) ir unikāla tikai SPACA6.Šīs atšķirības rada atšķirīgas domēna orientācijas diviem citādi līdzīgiem proteīniem.
Mūsu Dali servera meklēšana atklāja, ka SPACA6 un IZUMO1 ir vienīgās divas eksperimentāli noteiktās struktūras, kas saglabātas proteīnu datu bāzē un kurām ir šī konkrētā 4HB kroka (S1 tabula).Pavisam nesen DeepMind (Alphabet/Google) ir izstrādājis AlphaFold, neironu tīklu balstītu sistēmu, kas var precīzi paredzēt proteīnu 3D struktūras no primārajām sekvencēm48.Neilgi pēc tam, kad mēs atrisinājām SPACA6 struktūru, tika izlaista AlphaFold datu bāze, nodrošinot paredzamos struktūras modeļus, kas aptver 98, 5% no visiem cilvēka proteomā esošajiem proteīniem48, 49.Izmantojot mūsu atrisināto SPACA6 struktūru kā meklēšanas modeli, modeļa strukturālā homoloģijas meklēšana AlphaFold cilvēka proteomā identificēja kandidātus ar iespējamām strukturālām līdzībām ar SPACA6 un IZUMO1.Ņemot vērā AlphaFold neticamo precizitāti, prognozējot SPACA6 (S10.a att.) — it īpaši 1,1 Å rms ektodomēnu, salīdzinot ar mūsu atrisināto struktūru (S10b. att.), mēs varam būt pārliecināti, ka identificētās SPACA6 atbilstības, visticamāk, būs precīzas.
Iepriekš PSI-BLAST meklēja IZUMO1 kopu ar trim citiem ar spermu saistītiem proteīniem: IZUMO2, IZUMO3 un IZUMO450.AlphaFold prognozēja, ka šie IZUMO ģimenes proteīni salokās 4HB domēnā ar tādu pašu disulfīda saites modeli kā IZUMO1 (3.a un S11 attēls), lai gan tiem trūkst Ig līdzīga domēna.Pastāv hipotēze, ka IZUMO2 un IZUMO3 ir vienpusēji membrānas proteīni, kas līdzīgi IZUMO1, savukārt IZUMO4, šķiet, izdalās.IZUMO 2, 3 un 4 proteīnu funkcijas gametu saplūšanā nav noteiktas.Ir zināms, ka IZUMO3 spēlē lomu akrosomu bioģenēzē spermas attīstības laikā51, un ir konstatēts, ka IZUMO proteīns veido kompleksu50.IZUMO proteīnu saglabāšana zīdītājiem, rāpuļiem un abiniekiem liecina, ka to potenciālā funkcija atbilst citu zināmu ar gametu saplūšanu saistītu proteīnu, piemēram, DCST1/2, SOF1 un FIMP, funkcijai.
IST virsģimenes domēna arhitektūras diagramma ar 4HB, viru un Ig līdzīgiem domēniem, kas izcelti attiecīgi oranžā, zaļā un zilā krāsā.IZUMO4 ir unikāls C-termināla reģions, kas izskatās melns.Apstiprinātās un iespējamās disulfīda saites ir parādītas attiecīgi ar cietām un punktētām līnijām.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F9) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) tiek parādīti tajā pašā krāsu diapazonā kā panelis A. Disulfīda saites ir parādītas purpursarkanā krāsā.TMEM95, IZUMO2 un IZUMO3 transmembrānas spirāles nav parādītas.
Atšķirībā no IZUMO proteīna, tiek uzskatīts, ka citi SPACA proteīni (ti, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 un SPACA9) strukturāli atšķiras no SPACA6 (S12 att.).Tikai SPACA9 ir 4HB, taču nav sagaidāms, ka tam būs tāda pati paralēlā antiparalēlā orientācija vai tāda pati disulfīda saite kā SPACA6.Tikai SPACA1 ir līdzīgs Ig līdzīgs domēns.AlphaFold prognozē, ka SPACA3, SPACA4 un SPACA5 struktūra ir pilnīgi atšķirīga nekā SPACA6.Interesanti, ka ir zināms, ka SPACA4 arī spēlē lomu apaugļošanā, bet lielākā mērā nekā SPACA6, tā vietā veicinot spermas un oocītu zona pellucida mijiedarbību52.
Mūsu AlphaFold meklēšana atrada citu atbilstību IZUMO1 un SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, viens spermai specifisks transmembrānas proteīns, padara peles tēviņus neauglīgas, kad tās tiek ablētas 32,33.Spermatozoīdiem, kuriem trūka TMEM95, bija normāla morfoloģija, kustīgums un spēja iekļūt zona pellucida un saistīties ar olšūnas membrānu, bet tie nevarēja saplūst ar oocītu membrānu.Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka TMEM95 ir strukturālas līdzības ar IZUMO133.Patiešām, AlphaFold modelis apstiprināja, ka TMEM95 ir 4HB ar tādu pašu CXXC motīvu pāri kā IZUMO1 un SPACA6 un to pašu papildu disulfīda saiti starp spirālītēm 1 un 2, kas atrodama SPACA6 (3.a un S11. attēls).Lai gan TMEM95 trūkst Ig līdzīga domēna, tam ir reģions ar disulfīda saites modeli, kas ir līdzīgs SPACA6 un IZUMO1 eņģes reģioniem (3.b attēls).Šī manuskripta publicēšanas laikā pirmsdrukas serveris ziņoja par TMEM95 struktūru, apstiprinot AlphaFold53 rezultātu.TMEM95 ir ļoti līdzīgs SPACA6 un IZUMO1 un ir evolucionāri saglabājies jau abiniekiem (4. un S13. attēls).
PSI-BLAST meklēšanā tika izmantotas NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP un SOF1 datu bāzes, lai noteiktu šo secību atrašanās vietu dzīvības kokā.Attālumi starp atzarojuma punktiem netiek rādīti mērogā.
Pārsteidzošā vispārējā strukturālā līdzība starp SPACA6 un IZUMO1 liecina, ka tie ir konservētas strukturālas virsģimenes dibinātāji, kas ietver TMEM95 un IZUMO 2, 3 un 4 proteīnus.zināmie dalībnieki: IZUMO1, SPACA6 un TMEM95.Tā kā tikai dažiem locekļiem ir Ig līdzīgi domēni, IST superģimenes pazīme ir 4HB domēns, kuram ir unikālas iezīmes, kas raksturīgas visiem šiem proteīniem: 1) Satītas 4HB ar spirālēm, kas sakārtotas antiparalēlā/paralēlā maiņā (att. 5a), 2) saišķim ir trīsstūrveida virsma, kas sastāv no divām spirālēm kūlī un trešās vertikālās spirāles (att. atslēgas apgabals (5.c att.). Ir zināms, ka CXXC motīvs, kas atrodams tioredoksīnam līdzīgos proteīnos, darbojas kā redokssensors 54,55,56, savukārt IST ģimenes locekļu motīvs var būt saistīts ar proteīnu disulfīdu izomerāzēm, piemēram, ERp57 gametu saplūšanā. Lomas ir saistītas 57,58.
IST superģimenes locekļus nosaka trīs raksturīgās 4HB domēna pazīmes: četras spirāles, kas mainās starp paralēlu un antiparalēlu orientāciju, ba-trijstūra spirālveida saišķa virsmas un aptuveni CXXC dubultais motīvs, kas veidojas starp mazām molekulām.) N-gala spirāles (oranža) un eņģes apgabals β-matadata (zaļa).
Ņemot vērā SPACA6 un IZUMO1 līdzību, tika pārbaudīta pirmā spēja saistīties ar IZUMO1 vai JUNO.Bioslāņa interferometrija (BLI) ir uz kinētiku balstīta saistīšanās metode, kas iepriekš tika izmantota, lai kvantitatīvi noteiktu mijiedarbību starp IZUMO1 un JUNO.Pēc biotīna marķētā sensora inkubācijas ar IZUMO1 kā ēsmu ar augstu JUNO analīta koncentrāciju, tika atklāts spēcīgs signāls (S14a att.), kas norāda uz saistīšanās izraisītām izmaiņām sensora galam pievienotā biomateriāla biezumā.Līdzīgi signāli (ti, JUNO savienots ar sensoru kā ēsma pret IZUMO1 analītu) (S14b. attēls).Signāls netika atklāts, kad SPACA6 tika izmantots kā analīts pret sensoru saistītu IZUMO1 vai ar sensoru saistīto JUNO (attēls S14a, b).Šī signāla trūkums norāda, ka SPACA6 ekstracelulārais domēns nesadarbojas ar IZUMO1 vai JUNO ārpusšūnu domēnu.
Tā kā BLI tests ir balstīts uz brīvo lizīna atlieku biotinilēšanu uz ēsmas proteīna, šī modifikācija var novērst saistīšanos, ja mijiedarbībā ir iesaistītas lizīna atliekas.Turklāt saistīšanās orientācija attiecībā pret sensoru var radīt steriskus šķēršļus, tāpēc parastie nolaižamie testi tika veikti arī rekombinantajiem SPACA6, IZUMO1 un JUNO ektodomēniem.Neskatoties uz to, SPACA6 neizgulsnējās ar His-tagged IZUMO1 vai His-tagged JUNO (att. S14c, d), norādot, ka nav mijiedarbības saskaņā ar to, kas novērots BLI eksperimentos.Kā pozitīvu kontroli mēs apstiprinājām JUNO mijiedarbību ar marķēto His IZUMO1 (attēli S14e un S15).
Neskatoties uz strukturālo līdzību starp SPACA6 un IZUMO1, SPACA6 nespēja saistīt JUNO nav pārsteidzoša.Cilvēka IZUMO1 virsmā ir vairāk nekā 20 atlieku, kas mijiedarbojas ar JUNO, ieskaitot atlikumus no katra no trim reģioniem (lai gan lielākā daļa no tiem atrodas eņģes reģionā) (S14f att.).No šiem atlikumiem tikai viens ir saglabāts SPACA6 (Glu70).Lai gan daudzas atlieku aizvietošanas saglabāja savas sākotnējās bioķīmiskās īpašības, būtiskais Arg160 atlikums IZUMO1 tika aizstāts ar negatīvi lādētu Asp148 SPACA6;Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka Arg160Glu mutācija IZUMO1 gandrīz pilnībā atceļ saistīšanos ar JUNO43.Turklāt atšķirība domēna orientācijā starp IZUMO1 un SPACA6 ievērojami palielināja SPACA6 līdzvērtīgā reģiona JUNO saistošās vietas virsmas laukumu (S14g att.).
Neskatoties uz zināmo SPACA6 nepieciešamību gametu saplūšanai un tās līdzību ar IZUMO1, šķiet, ka SPACA6 nav līdzvērtīgas JUNO saistīšanas funkcijas.Tāpēc mēs esam centušies apvienot savus strukturālos datus ar pierādījumiem par svarīgumu, ko sniedz evolūcijas bioloģija.SPACA6 homologu secības saskaņošana parāda kopējās struktūras saglabāšanos ārpus zīdītājiem.Piemēram, cisteīna atliekas atrodas pat tālu radniecīgos abiniekos (6.a attēls).Izmantojot ConSurf serveri, uz SPACA6 virsmas tika kartēti 66 secību vairāku secību izlīdzināšanas saglabāšanas dati.Šāda veida analīze var parādīt, kuras atliekas ir saglabājušās olbaltumvielu evolūcijas laikā, un var norādīt, kuri virsmas reģioni spēlē lomu funkcijā.
SPACA6 ektodomēnu secības izlīdzināšana no 12 dažādām sugām, kas sagatavotas, izmantojot CLUSTAL OMEGA.Saskaņā ar ConSurf analīzi konservatīvākās pozīcijas ir atzīmētas zilā krāsā.Cisteīna atlikumi ir izcelti sarkanā krāsā.Domēna robežas un sekundārās struktūras elementi ir parādīti izlīdzinājuma augšdaļā, kur bultiņas norāda β-virknes un viļņi norāda spirāles.NCBI piekļuves identifikatori, kas satur sekvences, ir: cilvēks (Homo sapiens, NP_001303901), mandrils (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucīnu pērtiķis (Cebus mimic, XP_017359366), zirgs (Equus caballus), (Equus caballus), (Equus caballus, 06 w013) XP_032_034) .), aita (Ovis aries, XP_014955560), zilonis (Loxodonta africana, XP_010585293), suns (Canis lupus familyis, XP_025277208), pele (Mus musculus, NP_001156381, NP_001156381), Tasmanian devil ), pīļknābis, 8) , 61_89 un Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Numerācija ir balstīta uz cilvēku secību.b SPACA6 struktūras virsmas attēlojums ar 4HB augšpusē un Ig līdzīgu domēnu apakšā, krāsas balstās uz saglabāšanas aprēķiniem no ConSurf servera.Vislabāk saglabājušās daļas ir zilā krāsā, vidēji saglabājušās daļas ir baltā krāsā, bet vismazāk saglabājušās ir dzeltenā krāsā.violets cisteīns.Trīs virsmas ielāpi, kas demonstrē augstu aizsardzības līmeni, ir parādīti 1., 2. un 3. ielāpus. Ielaidumā augšējā labajā stūrī ir parādīta 4HB karikatūra (tāda pati krāsu shēma).
SPACA6 struktūrai ir trīs ļoti konservēti virsmas reģioni (6.b att.).1. ielāps aptver 4HB un eņģes reģionu, un tajā ir divi konservēti CXXC disulfīda tilti, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 eņģes tīkls (S7. attēls) un trīs konservēti ārējie aromātiskie atlikumi (Phe31, Tyr73, Phe137)).plašāka Ig līdzīga domēna mala (S6e att.), kas apzīmē vairākus pozitīvi lādētus atlikumus uz spermas virsmas.Interesanti, ka šis plāksteris satur antivielu epitopu, kas iepriekš ir pierādījis, ka tas traucē SPACA6 30 funkciju.3. apgabals aptver viru un vienu Ig līdzīgā domēna pusi;šajā reģionā ir konservēti prolīni (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) un uz āru vērsti polāri/uzlādēti atlikumi.Pārsteidzoši, ka lielākā daļa atlieku uz 4HB virsmas ir ļoti mainīgas (6.b att.), lai gan kroka ir saglabājusies visā SPACA6 homologā (par to liecina hidrofobā saišķa kodola konservatīvisms) un ārpus IST virsdzimtas.
Lai gan šis ir mazākais SPACA6 reģions ar vismazāk nosakāmiem sekundārās struktūras elementiem, daudzas viras reģiona paliekas (ieskaitot 3. reģionu) ir ļoti konservētas SPACA6 homologu vidū, kas var norādīt, ka spirālveida saišķa un β-sviestmaizes orientācijai ir nozīme.kā konservatīvs.Tomēr, neskatoties uz plašajām ūdeņraža saitēm un elektrostatiskajiem tīkliem SPACA6 un IZUMO1 eņģu reģionā, IZUMO137, 43, 44 vairāku atļauto struktūru izlīdzināšanā var redzēt raksturīgo elastību.Atsevišķo domēnu izlīdzināšana labi pārklājās, bet domēnu orientācija attiecībā pret otru mainījās no 50 ° līdz 70 ° no centrālās ass (S16. att.).Lai izprastu SPACA6 konformācijas dinamiku šķīdumā, tika veikti SAXS eksperimenti (S17a,b att.).SPACA6 ektodomēna ab initio rekonstrukcija atbilst stieņa kristāla struktūrai (S18 att.), lai gan Kratkija gabals uzrādīja zināmu elastības pakāpi (S17b att.).Šī konformācija kontrastē ar IZUMO1, kurā nesaistītais proteīns iegūst bumeranga formu gan režģī, gan šķīdumā43.
Lai īpaši identificētu elastīgo reģionu, SPACA6 tika veikta ūdeņraža-deitērija apmaiņas masas spektroskopija (H-DXMS) un salīdzināta ar datiem, kas iepriekš iegūti ar IZUMO143 (7.a, b att.).SPACA6 ir nepārprotami elastīgāks nekā IZUMO1, par ko liecina augstāka deitērija apmaiņa visā struktūrā pēc 100 000 s apmaiņas.Abās struktūrās eņģes reģiona C-gala daļa parāda augstu apmaiņas līmeni, kas, iespējams, ļauj ierobežoti 4HB un Ig līdzīgu domēnu rotāciju viens pret otru.Interesanti, ka SPACA6 eņģes C-gala daļa, kas sastāv no 147CDLPLDCP154 atlikuma, ir ļoti konservēts reģions 3 (6.b attēls), kas, iespējams, norāda, ka starpdomēnu elastība ir evolucionāri konservēta SPACA6 iezīme.Saskaņā ar elastības analīzi CD termiskā kausējuma dati parādīja, ka SPACA6 (Tm = 51,2 °C) ir mazāk stabils nekā IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (S1e un S19 att.).
a H-DXMS attēli SPACA6 un b IZUMO1.Deitērija apmaiņas procentuālais daudzums tika noteikts norādītajos laika punktos.Ūdeņraža-deitērija apmaiņas līmeņus norāda ar krāsu gradienta skalā no zilas (10%) līdz sarkanai (90%).Melnās kastes apzīmē lielas apmaiņas jomas.Kristāla struktūrā novērotās 4HB, eņģes un Ig līdzīgā domēna robežas ir parādītas virs primārās secības.Deitērija apmaiņas līmeņi 10 s, 1000 s un 100 000 s tika attēloti uz lentes diagrammas, kas uzlikta uz SPACA6 un IZUMO1 caurspīdīgajām molekulārajām virsmām.Struktūru daļas ar deitērija apmaiņas līmeni zem 50% ir iekrāsotas baltā krāsā.Apgabali, kas pārsniedz 50% H-DXMS apmaiņas, ir iekrāsoti gradienta skalā.
CRISPR/Cas9 un peles gēnu izslēgšanas ģenētisko stratēģiju izmantošana ir ļāvusi identificēt vairākus faktorus, kas ir svarīgi spermas un olšūnu saistīšanai un saplūšanai.Neatkarīgi no labi raksturotās IZUMO1-JUNO un CD9 struktūras mijiedarbības, lielākā daļa proteīnu, kas saistīti ar gametu saplūšanu, joprojām ir strukturāli un funkcionāli mīklaini.SPACA6 biofizikālais un strukturālais raksturojums ir vēl viens adhēzijas / saplūšanas molekulārās mīklas gabals apaugļošanas laikā.
SPACA6 un citi IST virsdzimtas locekļi, šķiet, ir ļoti konservēti zīdītājiem, kā arī atsevišķiem putniem, rāpuļiem un abiniekiem;patiesībā tiek uzskatīts, ka SPACA6 ir pat nepieciešams zebrafish 59 apaugļošanai. Šis sadalījums ir līdzīgs citiem zināmiem ar gametu saplūšanu saistītiem proteīniem, piemēram, DCST134, DCST234, FIMP31 un SOF132, kas liecina, ka šiem faktoriem ir HAP2 deficīts (arī pazīstami kā GCS1) proteīni, kas ir atbildīgi par daudzu protistu katalītisko aktivitāti., augi un posmkāji.Apaugļotas saplūšanas olbaltumvielas 60, 61. Neskatoties uz spēcīgo strukturālo līdzību starp SPACA6 un IZUMO1, gēnu, kas kodē kādu no šiem proteīniem, izslēgšana izraisīja neauglību peļu tēviņiem, norādot, ka to funkcijas gametu saplūšanā netiek dublētas..Plašāk runājot, neviens no zināmajiem spermas proteīniem, kas nepieciešami saplūšanas adhēzijas fāzei, nav lieks.
Joprojām ir atklāts jautājums, vai SPACA6 (un citi IST superģimenes locekļi) piedalās starpspēļu savienojumos, veido intragamētiskos tīklus, lai piesaistītu svarīgus proteīnus saplūšanas punktos, vai varbūt pat darbojas kā nenotverami fuzogēni.Līdzimunoprecipitācijas pētījumi HEK293T šūnās atklāja mijiedarbību starp pilna garuma IZUMO1 un SPACA632.Tomēr mūsu rekombinantie ektodomēni in vitro nesadarbojās, kas liecina, ka mijiedarbība, kas novērota Noda et al.abi tika izdzēsti konstrukcijā (ņemiet vērā IZUMO1 citoplazmas asti, kas ir pierādīta kā nevajadzīga apaugļošanai62).Alternatīvi, IZUMO1 un/vai SPACA6 var būt nepieciešama specifiska saistīšanās vide, ko mēs neatveidojam in vitro, piemēram, fizioloģiski specifiskas konformācijas vai molekulārie kompleksi, kas satur citus proteīnus (zināmus vai vēl neatklātus).Lai gan tiek uzskatīts, ka IZUMO1 ektodomēns veicina spermatozoīdu piesaisti olšūnai perivitelīna telpā, SPACA6 ektodomēna mērķis nav skaidrs.
SPACA6 struktūra atklāj vairākas konservētas virsmas, kas var būt iesaistītas olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbībā.Konservētajā eņģes apgabala daļā, kas atrodas tieši blakus CXXC motīvam (apzīmēts ar 1. plāksni iepriekš), ir vairāki uz āru vērsti aromātiski atlikumi, kas bieži ir saistīti ar hidrofobu un π-kraušanas mijiedarbību starp biomolekulām.Ig līdzīgā domēna plašās malas (2. reģions) veido pozitīvi lādētu rievu ar ļoti konservētiem Arg un His atlikumiem, un antivielas pret šo reģionu iepriekš tika izmantotas, lai bloķētu gametu saplūšanu30.Antiviela atpazīst lineāro epitopu 212RIRPAQLTHRGTFS225, kurā ir trīs no sešiem arginīna atlikumiem un ļoti konservēts His220.Nav skaidrs, vai disfunkcija ir saistīta ar šo konkrēto atlikumu vai visa reģiona bloķēšanu.Šīs spraugas atrašanās vieta netālu no β-sviestmaizes C-gala norāda uz cis-mijiedarbību ar blakus esošajiem spermas proteīniem, bet ne ar oocītu proteīniem.Turklāt ļoti elastīga, ar prolīnu bagāta mudžekļa (3. vieta) saglabāšana eņģē var būt proteīna-olbaltumvielu mijiedarbības vieta vai, visticamāk, norādīt uz elastības saglabāšanu starp abiem domēniem.Dzimums ir svarīgs SPACA6 nezināmajai lomai.gametu saplūšana.
SPACA6 piemīt starpšūnu adhēzijas proteīnu īpašības, tostarp Ig līdzīgas β-sviestmaizes.Daudziem adhezīviem proteīniem (piemēram, kadherīniem, integrīniem, adhezīniem un IZUMO1) ir viens vai vairāki β-sendviča domēni, kas paplašina proteīnus no šūnu membrānas līdz to vides mērķiem63, 64, 65.SPACA6 Ig līdzīgais domēns satur arī motīvu, kas parasti sastopams adhēzijas un kohēzijas β-sviestmaizēs: paralēlu šķiedru dubleti β-sviestmaižu galos, kas pazīstami kā mehāniskās skavas66.Tiek uzskatīts, ka šis motīvs palielina izturību pret bīdes spēkiem, kas ir vērtīgs proteīniem, kas iesaistīti starpšūnu mijiedarbībā.Tomēr, neskatoties uz šo līdzību ar adhezīniem, pašlaik nav pierādījumu, ka SPACA6 mijiedarbojas ar olu baltumiem.SPACA6 ektodomēns nespēj saistīties ar JUNO, un SPACA6 ekspresējošās HEK293T šūnas, kā parādīts šeit, gandrīz nesadarbojas ar oocītiem, kuriem trūkst zonas 32 .Ja SPACA6 izveido starpspēļu saites, šīm mijiedarbībām var būt nepieciešamas pēctranslācijas modifikācijas vai tās var stabilizēt ar citiem spermas proteīniem.Lai atbalstītu pēdējo hipotēzi, spermatozoīdi ar IZUMO1 deficītu saistās ar oocītiem, parādot, ka gametas adhēzijas posmā ir iesaistītas citas molekulas, izņemot IZUMO127.
Daudziem vīrusu, šūnu un attīstības saplūšanas proteīniem ir īpašības, kas paredz to kā fuzogēnu funkciju.Piemēram, vīrusu saplūsmes glikoproteīniem (I, II un III klase) proteīna galā ir hidrofobs saplūsmes peptīds vai cilpa, kas tiek ievietota saimnieka membrānā.IZUMO143 hidrofilitātes karte un IST virsģimenes struktūra (noteiktā un prognozētā) neuzrādīja acīmredzamu hidrofobu saplūšanas peptīdu.Tādējādi, ja kādi proteīni IST virsģimenē darbojas kā fuzogēni, tie to dara savādāk nekā citi zināmi piemēri.
Noslēgumā jāsaka, ka ar gametu saplūšanu saistīto proteīnu IST superģimenes locekļu funkcijas joprojām ir aizraujošs noslēpums.Mūsu raksturotā SPACA6 rekombinantā molekula un tās atrisinātā struktūra sniegs ieskatu attiecībās starp šīm kopīgajām struktūrām un to lomu gametu piesaistē un saplūšanā.
DNS sekvence, kas atbilst prognozētajam cilvēka SPACA6 ektodomēnam (NCBI pievienošanās numurs NP_001303901.1; atlikumi 27–246), tika optimizēta kodonam ekspresijai Drosophila melanogaster S2 šūnās un sintezēta kā gēna fragments ar secību, kas kodē Kozaku (Eurofins Genomics)., BiP sekrēcijas signāls un attiecīgie 5′ un 3′ gali šī gēna no ligācijas neatkarīgai klonēšanai pMT ekspresijas vektorā, kura pamatā ir metalotioneīna promotors, kas modificēts atlasei ar puromicīnu (pMT-puro).Vektors pMT-puro kodē trombīna šķelšanās vietu, kam seko 10x-His C-gala marķējums (S2 attēls).
SPACA6 pMT-puro vektora stabila transfekcija D. melanogaster S2 (Gibco) šūnās tika veikta līdzīgi protokolam, ko izmantoja IZUMO1 un JUNO43.S2 šūnas tika atkausētas un audzētas Schneider barotnē (Gibco), kas papildināta ar 10% (v/v) termiski inaktivētu teļa augļa serumu (Gibco) un 1x antimycotic antibiotiku (Gibco).Agrīnās pasāžas šūnas (3,0 x 106 šūnas) tika izklātas atsevišķās 6 iedobju plākšņu (Corning) iedobēs.Pēc 24 stundu inkubācijas 27 ° C temperatūrā šūnas tika transficētas ar 2 mg SPACA6 pMT-puro vektora un Effectene transfekcijas reaģenta (Qiagen) maisījumu saskaņā ar ražotāja protokolu.Transfektētās šūnas inkubēja 72 stundas un pēc tam savāca ar 6 mg / ml puromicīna.Pēc tam šūnas tika izolētas no pilnīgas Schneider barotnes un ievietotas serumu nesaturošā Insect-XPRESS barotnē (Lonza) liela mēroga olbaltumvielu ražošanai.1 l S2 šūnu kultūras partija tika audzēta līdz 8–10 × 106 ml-1 šūnām 2 l ventilējamā plakandibena polipropilēna Erlenmeijera kolbā un pēc tam sterilizēta ar galīgo koncentrāciju 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) un sterili filtrēta.izraisīts.Inducētās kultūras četras dienas inkubēja 27°C ar ātrumu 120 apgr./min.
Kondicionētā barotne, kas satur SPACA6, tika izolēta, centrifugējot pie 5660 × g 4 ° C temperatūrā, kam sekoja Centramate tangenciālās plūsmas filtrēšanas sistēma (Pall Corp) ar 10 kDa MWCO membrānu.Uzklājiet koncentrētu barotni, kas satur SPACA6, 2 ml Ni-NTA agarozes sveķu (Qiagen) kolonnā.Ni-NTA sveķus mazgā ar 10 kolonnas tilpumiem (CV) buferšķīduma A un pēc tam pievienoja 1 CV buferšķīduma A, lai iegūtu galīgo imidazola koncentrāciju 50 mM.SPACA6 tika eluēts ar 10 ml buferšķīduma A, kas papildināts ar imidazolu līdz galīgajai koncentrācijai 500 mM.Restrikcijas klases trombīns (Millipore Sigma) tika pievienots tieši dialīzes caurulei (MWCO 12-14 kDa) pa 1 vienību uz mg SPACA6 pret 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 un 150 mM NaCl (buferis B) dialīzes vajadzībām.) 4°C temperatūrā 48 stundas.Pēc tam ar trombīnu šķelto SPACA6 atšķaidīja trīs reizes, lai samazinātu sāls koncentrāciju, un ievietoja 1 ml MonoS 5/50 GL katjonu apmaiņas kolonnā (Cytiva / GE), kas līdzsvarota ar 10 mM Tris-HCl, pH 7, 5.Katjonu apmainītājs tika mazgāts ar 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, pēc tam SPACA6 tika eluēts ar lineāru gradientu no 0 līdz 500 mM NaCl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 25 CV.Pēc jonu apmaiņas hromatogrāfijas SPACA6 tika koncentrēts līdz 1 ml un izokrātiski eluēts no ENrich SEC650 10 x 300 kolonnas (BioRad), kas līdzsvarota ar buferšķīdumu B. Saskaņā ar hromatogrammu, apvienojiet un koncentrātu frakcijas, kas satur SPACA6.Tīrību kontrolēja ar Coomassie krāsotu elektroforēzi uz 16% SDS-poliakrilamīda gēla.Olbaltumvielu koncentrācija tika kvantificēta ar absorbciju pie 280 nm, izmantojot Beer-Lambert likumu un teorētisko molārās ekstinkcijas koeficientu.
Attīrīts SPACA6 tika dializēts nakti pret 10 mM nātrija fosfātu, pH 7, 4 un 150 mM NaF, un pirms analīzes ar CD spektroskopiju tika atšķaidīts līdz 0, 16 mg / ml.CD ar viļņa garumu no 185 līdz 260 nm spektrālā skenēšana tika savākta ar Jasco J-1500 spektropolarimetru, izmantojot kvarca kivetes ar 1 mm optiskā ceļa garumu (Helma) 25 ° C temperatūrā ar ātrumu 50 nm / min.CD spektri tika koriģēti pēc bāzes līnijas, aprēķināti vidēji 10 ieguvumos un pārveidoti par vidējo atlikušo eliptitāti (θMRE) grādos cm2/dmol:
kur MW ir katra parauga molekulmasa Da;N ir aminoskābju skaits;θ ir eliptiskums miligrādos;d atbilst optiskā ceļa garumam cm;olbaltumvielu koncentrācija vienībās.