310 10 * 1mm Nerūsējošā tērauda tinuma cauruļu ķīmiskā sastāvdaļa, spidroīna N-gala domēni veido hidrogēlus, kuru pamatā ir amiloīda šķiedras, un nodrošina platformu proteīnu imobilizācijai.

Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Turklāt, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs rādām vietni bez stiliem un JavaScript.
Slīdņi, kas parāda trīs rakstus katrā slaidā.Izmantojiet pogas Atpakaļ un Nākamais, lai pārvietotos pa slaidiem, vai slaidu kontrollera pogas beigās, lai pārvietotos pa katru slaidu.

Specifikācija

310 10*1mm nerūsējošā tērauda tinumu cauruļu piegādātāji

Ķīmiskais sastāvs

Mehāniskās īpašības

Rekombinantajiem zirnekļa zīda proteīniem (zirnekļa zīda proteīniem) ir daudz potenciālu pielietojumu jaunu biomateriālu izstrādē, taču to multimodālais un agregācijai pakļautais raksturs padara tos grūti iegūstamus un viegli lietojamus.Šeit mēs ziņojam, ka rekombinantie miniatūrie spidroīna proteīni un, kas ir svarīgi, pats N-terminālais domēns (NT) ātri veido pašnesošus un caurspīdīgus hidrogelus 37 ° C temperatūrā.saplūšanas olbaltumvielas, kas sastāv no NT un zaļā fluorescējošā proteīna vai purīna nukleozīdu fosforilāzes, veido pilnībā funkcionālus saplūsmes proteīnus.Hidrogēli.Mūsu rezultāti liecina, ka rekombinantie NT un saplūšanas proteīni nodrošina augstu ekspresijas ražu un piešķir hidrogēliem pievilcīgas īpašības, piemēram, caurspīdīgumu, želeju bez šķērssaistīšanas un tiešu aktīvo proteīnu imobilizāciju ar augstu blīvumu.
Zirnekļiem ir pat septiņi dažādi zīda dziedzeru komplekti, no kuriem katrs ražo noteikta veida zīdu.Visas septiņas zīda sugas sastāv no zirnekļa zīda proteīniem (spidroīniem), kuru garums ir aptuveni 6000 atlieku, un tajās ir liels centrālais atkārtojuma apgabals, ko ieskauj sfēriski N- un C-gala domēni (NT un CT)1,2.Visplašāk pētīto zīda veidu, primāro ampulu, ražo primārais ampulas dziedzeris.Šajā dziedzerī epitēlija šūnu monoslānis sintezē spidroīna proteīnus un izdalās tos dziedzera lūmenā, kur tie atrodas šķīstošā veidā (dopings) ārkārtīgi augstā koncentrācijā (30–50% w/v)3,4.Galveno ampulāra spidroīna proteīnu organizācija un konformācija dziedzerī ir apspriesta, taču lielākā daļa eksperimentālo pierādījumu liecina par vispārēji spirālveida un / vai nejaušas spirālveida konformācijas un micelāru vai slāņainu struktūru klātbūtni 5, 6, 7, 8, 9, 10.Kamēr atkārtotie domēni regulē zīda šķiedru mehāniskās īpašības, veidojot β-loksnes nanokristālus un amorfas struktūras 11, 12, 13, 14, 15, gala domēni regulē zīda šķiedras, reaģējot uz mainīgajiem apstākļiem gar zīda dziedzeri 16, 17, 18.Kontrolējot zīda veidošanos, 19. Terminālie domēni ir evolucionāri konservēti, un to funkcija var būt kopīga visiem spidroīna proteīniem 2,20,21.Izejot cauri dziedzerim, spidroīna pH pazeminās no aptuveni 7,6 līdz < 5,716 un palielinās ar bīdes un stiepšanās palīdzību, ko izraisa kustība pa pakāpeniski sašaurinošo kanālu.Šķīdumā CT ir α-spirālveida konstitutīvs paralēls dimērs17, taču, reaģējot uz zemu pH un bīdes spēkiem, CT izvēršas un pārslēdz β-slāņus16, 17, iespējams, izraisot β-slāņus Convert 16 atkārtotajos reģionos. NT ir monomērs zem. apstākļi, kas atspoguļo apstākļus dziedzera lūmenā un veicina spidroīna šķīdību, bet pie pazemināta pH daudzu karbonskābes sānu ķēžu protonēšana noved pie NT dimerizācijas ar pKa aptuveni 6,5, tādējādi stabilizējot NT un fiksējot spidroīnu lielos daudzumos. daudzumus.tīkli16,18.Tādējādi NT ir galvenā loma kvēldiega veidošanā, pārejot no monomēra pārklājumā uz dimēru šķiedrā 23, 24, 25.NT joprojām ir ļoti šķīstošs un spirālveida visos līdz šim pētītajos apstākļos16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, kas iedvesmoja tā attīstību kā šķīdību uzlabojošu etiķeti heterologu proteīnu ražošanai.
Rekombinants mini zirnekļa zīda proteīns, kas sastāv no viena NT, viena īsa atkārtojuma apgabala, viena CT un His6 marķējuma (His-NT2RepCT) attīrīšanai, ir tikpat šķīstošs ūdens buferšķīdumā kā dabiskais zirnekļa zīda proteīns un atdarina zīda zirnekļa dabiskās svarīgās īpašības. .pārklājums 25.31.His-NT2RepCT var savērpt nepārtrauktās šķiedrās, izmantojot biomimētisko iekārtu, kurā pH 8 šķīstošs pārklājums tiek izspiests ūdens vannā ar pH 525, 32, 33, 34, 35.E. coli, kas ekspresē His-NT2RepCT, bioreaktora fermentācija un sekojoša pēcapstrāde radīja >14 g/l iznākumu pēc attīrīšanas.His-NT2RepCT augstā raža, augstā šķīdība un adekvāta reakcija uz skābiem apstākļiem ir attiecināma uz NT23, 25, 34.
Šeit mēs ziņojam par ātru caurspīdīgu hidrogēlu veidošanos no rekombinantiem spidroīna proteīniem, ieskaitot tikai NT, inkubējot proteīna šķīdumu 37 ° C temperatūrā.Izmantojot tioflavīna T fluorescenci (ThT), Furjē transformācijas infrasarkano spektroskopiju (FTIR), kodolmagnētiskās rezonanses spektroskopiju (NMR) un transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM), mēs noskaidrojām, ka NT un mikrozirnekļa proteīni strukturāli pārveidojas par β-loksnēm un amiloīdiem līdzīgām fibrilām. kad veidojas želejas.Turklāt NT un zaļās fluorescējošās olbaltumvielas (GFP) vai purīna nukleozīdu fosforilāzes (PNP) saplūšanas proteīni veido hidrogēlus ar pilnībā funkcionāliem saplūšanas fragmentiem.Augstas caurlaidības ekspresija heterologos saimniekos kopā ar ātru hidrogēlu veidošanos fizioloģiskos apstākļos paver iespēju rentabli ražot hidrogēlus ar inženierijas funkcijām.
Atšķirībā no vairuma ziņoto rekombinanto spidroīna proteīnu36, His-NT2RepCT ir stabils Tris-HCl buferšķīdumā pie pH 8, un to var koncentrēt līdz 500 mg/ml bez nokrišņiem25.Tāpēc mēs bijām pārsteigti, atklājot, ka šis proteīns, inkubējot 37 °C temperatūrā, ātri veido optiski skaidrus, pašnesošus hidrogēlus (1.b-d attēls).Turpmākie pētījumi parādīja, ka His-NT2RepCT želeja notika plašā olbaltumvielu koncentrāciju diapazonā (10–300 mg/ml) un ka šī koncentrācija bija apgriezti korelēta ar želejas laiku (1.c attēls un 1. papildu attēls).Lai noskaidrotu, kuras His-NT2RepCT daļas mediē hidrogēla veidošanos, mēs pārbaudījām katru domēnu atsevišķi un dažādās kombinācijās, izmantojot kolbas inversijas testu (1.a, b attēls).Visas pārbaudītās rekombinantā spidroīna frakcijas veidoja želejas (ar proteīna koncentrāciju 300 mg/ml) mazāk nekā 1 h laikā, izņemot izgulsnēto 2Rep (1.b att.).Tas liek domāt, ka NT un CT atsevišķi, kombinācijā vai kopā ar atkārtojumiem, var saželēt 37 ° C temperatūrā un ka His6 marķējums šo procesu būtiski neietekmē.Ņemot vērā izplatīto priekšstatu, ka NT ir ļoti šķīstošs un stabils proteīns, un ka iepriekšējie ziņojumi par rekombinantiem spidroīna hidrogēliem ir attiecinājuši želejas efektus uz konformācijas izmaiņām atkārtotos reģionos un / vai CT, NT pati varētu būt.Želācijas atklāšana bija negaidīta.Papildu tabula 1) 37, 38, 39. Jāatzīmē, ka NT jau saželēja 10 minūšu laikā koncentrācijā ≥ 300 mg/ml (1.c attēls).Flakona inversijas eksperimenti ar dažādām NT koncentrācijām parādīja, ka pie > 50 mg/ml NT šķīdums saželēja ātrāk nekā His-NT2RepCT attiecīgajā koncentrācijā (w/v, 1.c attēls).
Dažādu šajā darbā pētīto spidroīna konstrukciju shematisks attēlojums.b Želejas laiks 37 °C temperatūrā dažādiem rekombinantiem spidroīna proteīniem (300 mg/ml), kas pārbaudīts, apgriežot flakonu.CT gēls nekavējoties bez inkubācijas (<300 mg/mL), 2Rep nogulsnes (300 mg/ml, 5 mm skala).c His-NT2RepCT un NT želejas laiks norādītajās olbaltumvielu koncentrācijās 37 ° C temperatūrā.d His-NT2RepCT un NT hidrogēlu fotogrāfijas ar attiecīgi uzdrukātu zirnekli un burtu “NT” (abi 200 mg/mL, mēroga josla 5 mm).
Hidrogēliem, ko veido dažādi rekombinantie spidroīna proteīni, ir nedaudz atšķirīgas krāsas, un novērojumi ar neapbruņotu aci uzrāda dažādas caurspīdīguma pakāpes (1.b att.).NT gēli ir īpaši dzidri, savukārt citi gēli kļūst necaurspīdīgi.His-NT2RepCT un NT gēlus, kas ielieti cilindriskās caurulēs, varēja izņemt no veidnes neskartus (1.d attēls).
Lai pārbaudītu, vai dabiskie zirnekļa zīda pārklājumi saželē apstākļos, par kuriem tagad konstatēts, ka tie izraisa rekombinanto spidroīna proteīnu želeju, pārklājumi tika savākti no Zviedrijas tilta zirnekļa (Larinioides sclopetarius) lielās ampulas dziedzera.Pārklājumi tika uzglabāti 20 mM Tris-HCl buferšķīdumā ar 50 mg / ml (pamatojoties uz izmērīto sauso svaru), bet 21 dienu inkubācijas laikā 37 ° C temperatūrā netika novērota želeja (papildu attēls 2a).
Lai kvantitatīvi noteiktu šos gēlus, var izmantot reoloģiskos mērījumus, lai pētītu želejas procesu un noteiktu vispārējās mehāniskās īpašības.Jo īpaši uzglabāšanas moduļa (elastības) uzraudzība paaugstinātā temperatūrā var sniegt informāciju par želejas temperatūru, kā arī pārklājuma viskoelastīgajām īpašībām.Temperatūras paaugstināšanas eksperimenti (izmantojot 1°C/min pie 25-45°C, pamatojoties uz iepriekšējiem pētījumiem, izmantojot dabīgā zīda pamatšķīdumus)40,41 parādīja, ka His-NT2RepCT un NT šķīdumu uzglabāšanas moduļi palielinājās, palielinoties temperatūrai .tika palielināts (2. att. un 3. papildu att.).Proti, NT modulis sāka augt zemākā temperatūrā, salīdzinot ar His-NT2RepCT, kas atbilst ātrākam želejas laikam, kas novērots, kad NT tika tieši inkubēts ar His-NT2RepCT 37 ° C temperatūrā (1. attēls).Pēc sekojošas temperatūras pazemināšanās uzglabāšanas modulis neatgriezās pie zemākām vērtībām un palika virs zudumu moduļa (sk. Papildu 3. attēlu), norādot uz termiski neatgriezenisku stabilu želeju.Pēc želejas galīgais elastības modulis bija robežās no 15 līdz 330 kPa His-NT2RepCT hidrogēliem koncentrācijā 100–500 mg/ml, un galīgais elastības modulis NT hidrogēliem (100–500 mg/mL) bija no 2 līdz 1400. kPa (att. , 2 un pilni rampas dati) skatiet 3. papildu attēlu).
a Temperatūras izmaiņas His-NT2RepCT (300 mg/ml) un b NT (300 mg/ml) mērījumu laikā ar kratīšanu.Bultiņas norāda temperatūras tendenci, un glabāšanas moduļa datu gaišāks ēnojums attēlo testēšanu ar zemākām instrumenta griezes momenta vērtībām, nekā norādījis ražotājs, kas ir paaugstinātā trokšņa cēlonis.c His-NT2RepCT un NT beigu moduļa uzkrāšanās pēc paaugstinātas temperatūras (100, 300 un 500 mg/ml).Visi moduļa rādījumi tiek ņemti ar frekvenci 0,1 Hz.
Kā potenciālu metodi ar želeju saistīto konformācijas izmaiņu izpētei mēs reģistrējām His-NT2RepCT un NT FTIR spektrus pirms un pēc želejas 37 ° C temperatūrā (3.a, b attēls).Kā gaidīts, His-NT2RepCT un NT šķīdumu spektri atbilda proteīniem, kuriem bija α-spirāles / nejaušas spoles sekundārā struktūra ar izteiktu joslu pie 1645 cm-1.Abiem hidrogēliem želejas rezultātā vidējā I joslā izveidojās divas rokas pie aptuveni 1617 cm-1 un 1695 cm-1 (3.a, b att.), kas liecina par antiparalēlu β-loksnes struktūru veidošanos.Šīs izmaiņas var skaidri redzēt arī attiecīgajā otrajā atvasinājuma un atšķirības želejas spektros (papildu 4.b attēls).Abas NT β slāņa joslas bija izteiktākas nekā His-NT2RepCT, norādot, ka kopējais β slāņa joslu saturs NT hidrogēlā bija augstāks nekā NT2RepCT hidrogēlā.
His-NT2RepCT un b NT (abi 500 mg/ml) FTIR absorbcijas spektri pirms (šķīdums) un pēc (gela) inkubācijas 37°C temperatūrā.c atkārtoti suspendētu 50 mg/ml NT2RepCT gēlu un d NT TEM attēli.Mēroga josla 200 nm.e His-NT2RepCT un NT hidrogēlu šķiedru diametri.n = 100 izmērītu fibrilu, p < 0,0001.Kļūdu joslas parāda standarta novirzi.Kļūdu joslu centrs ir vidējais.Statistiskajai analīzei tika izmantots nesapārots t-tests (divu zaru).f dažādu rekombinanto spidroīna proteīnu (100 mg/ml) ThT fluorescence 37 °C temperatūrā bez kratīšanas.g NT (100 mg/mL) inokulācijas eksperimenti no 100 mg/mL NT gēla ar 0%, 5%, 10% un 20% sēklām.
Gēla analīze, izmantojot transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM), parādīja, ka hidrogēls sastāv no amiloīdiem līdzīgām fibrilām (3.c, 3.d att.).NT veidotās fibrillas bija iegarenas (5–12 nm diametrā) un nesazarotas, savukārt His-NT2RepCT fibrillas bija īsākas garumā un ievērojami platākas diametrā (7–16 nm) (3.e att.).Šie rezultāti ļāva mums sekot fibrozes kinētikai, izmantojot tioflavīna T (ThT) testu.Visiem rekombinantajiem spidroīna proteīniem fluorescējošais signāls palielinājās, kad paraugi tika inkubēti 37 °C temperatūrā (3.f att., papildu 5.a attēls).Saskaņā ar šo konstatējumu, mikroskopiskā NT un His-NT2RepCT pārbaude želejas apstākļos atklāja vienmērīgu ThT fluorescences pieaugumu bez ievērojamas ThT pozitīvo agregātu lokālas uzkrāšanās (papildu attēls 5b, c).ThT pozitīvo fibrilu veidošanās nebija saistīta ar NT un His-NTCT duļķainības palielināšanos (papildu attēls 5d), kas nozīmē, ka fibrilu tīkls gēlā varētu veidoties, neapdraudot gēla skaidrību.Sēšana, pievienojot nelielu daudzumu iepriekš izveidotu fibrilu, var ievērojami paātrināt dažu amiloīdu šķiedru veidošanos42, 43, 44, bet pievienojot NT hidrokoagulantu šķīdumam 5%, 10% vai 20% (w/w) NT.sēšanas efekts (3.g att.).Varbūt tas ir saistīts ar faktu, ka fibrillas hidrogēlā ir relatīvi fiksētas un nevar tikt izmantotas kā sēklas.
Rekombinanto spidroīna proteīnu negaidītā uzvedība augstās temperatūrās pamudināja veikt turpmākus kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) spektroskopijas pētījumus, lai identificētu ar gēla veidošanos saistītās konformācijas izmaiņas.His-NT2RepCT šķīdumu KMR spektri, kas reģistrēti laika gaitā 37 °C temperatūrā, parādīja, ka CT joprojām bija daļēji salocīts, turpretim NT un 2Rep signāli bija pazuduši (4.a attēls), kas liecina, ka galvenokārt NT un 2Rep bija tie, kas daļēji kontrolēja His- NT2RepCT hidrogēls.CT signāls tika arī vājināts līdz 20% no sākotnējās intensitātes, kas liecina, ka arī CT lielākoties ir fiksēts un iekļauts hidrogēla struktūrā.Mazākai CT daļai, kas ir tikpat kustīga kā iepriekš inkubētajā paraugā un tādējādi tiek novērota ar šķīduma KMR, spektros trūkst signālu pirmajiem 10 strukturētajiem atlikumiem, iespējams, tāpēc, ka His-NT2Rep pievienotā daļa ir sarežģīta imobilizācija.Hidrogēlu -NT2RepCT stāvokļa KMR spektri atklāja dominējošo α-spirāļu un β-slāņu klātbūtni un mazākā mērā nejaušu spoles konformāciju (4.b attēls).Metionīna atlikumu ķīmiskās nobīdes analīze, kas atrodas tikai NT, parādīja, ka šis domēns ir pārveidots par β-loksnes struktūru.No laika atkarīgie NT spektri šķīdumā uzrādīja vienmērīgu signāla intensitātes samazināšanos (4.c att.), un NT hidrogēlu cietvielu KMR parādīja, ka lielākā daļa NT atlikumu tika pārveidoti par β-loksnes struktūrām (4.d attēls).2Rep konformāciju nevarēja noteikt atsevišķi, jo tai ir tendence apvienoties.Tomēr NTCT un His-NT2RepCT hidrogēlu cietvielu KMR spektri izskatījās ļoti līdzīgi (4.b att.; papildu 6.b att.), kas liecina, ka 2Rep maz ietekmēja His-NT2RepCT hidrogēla strukturālo daļu.Tika konstatēts, ka CT hidrogēliem pastāv α-spirāles, β-loksnes un nejaušas spirālveida sekundārās struktūras (papildu 6.d attēls).Tas liecina, ka dažas CT daļas paliek α-spirāles, bet citas kļūst par β-loksnēm.Tādējādi KMR spektroskopijas rezultāti liecina, ka NT ir svarīgs hidrogēla veidošanai un arī pārvēršas β-loksnes konformācijā, sapludinot ar 2Rep un CT.Saskaņā ar to mēs nesen atklājām, ka amiloīda telpiskie rāvējslēdzēji, iespējams, veidojas visās piecās NT domēna spirālēs, un Valša algoritms paredzēja amiloidogēno reģionu 1. spirālē (4.e attēls).
15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT šķīduma 2D spektri pirms (zils) un 19 stundas pēc inkubācijas (sarkans) 37°C temperatūrā.Atsevišķas krusteniskās virsotnes sarkanajā spektrā un F24, G136, poliA zilajā spektrā apzīmē ar viena burta aminoskābju simboliem un atlikuma cipariem.Ielaidumi parāda signāla intensitātes atkarību no laika atlasītajiem atlikumiem no NT, 2Rep un CT domēniem.b His-NT2RepCT hidrogēlu cietvielu radiofrekvenču (RFDR) spektri.RFDR spektros novērotās Cα/Cβ atlieku korelācijas tika noteiktas, salīdzinot ar modeļa peptīdu ķīmiskajām nobīdēm un vērtībām, kas iegūtas no statistikas82,83 un to sekundārajām struktūrām.SSB – rotējoša sānjosla.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT šķīduma viendimensijas spektri inkubācijas laikā 37 °C 36 stundas.Ielaidums parāda tilpuma intensitāti pret laiku.d NT hidrogēlu cietvielu RFDR spektri.Norādītas RFDR spektros novērotās Cα/Cβ atlieku un to sekundāro struktūru korelācijas.e Pamatojoties uz NT45.79 fibrilācijas tieksmes profilu no Zipper datu bāzes (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Heksapeptīda telpiskās zibens nobīdes loga Rosetta enerģija ir parādīta kcal/mol.Sarkanās joslas apzīmē heksapeptīdus ar augstu fibrozes tendenci (Rosetta enerģija zem -23 kcal/mol; zem punktētās līnijas).Zaļās joslas norāda uz fragmentiem, kuru Rosetta enerģija pārsniedz slieksni, un tāpēc ir mazāka iespēja veidot steriskus rāvējslēdzējus.Fragmenti, kas satur prolīnu, tika izslēgti no analīzes (bez kolonnām).Kvadrāti norāda amiloidozes apgabalus, ko paredz Waltz algoritms81 (https://waltz.switchlab.org).NT aminoskābju atlikumu secība ir augšpusē, un β sekundārajā struktūrā atrastie atlieku veidi (noteikti ar cietvielu NMR spektroskopiju) ir parādīti sarkanā krāsā.Piecu NT α-spirāļu pozīcijas ir apzīmētas kā (H1-H5)28.
Pie pH <6,5 HT dimerizējas, būdams izturīgs pret karstuma vai urīnvielas izraisītu denaturāciju18.Lai noskaidrotu, kā NT dimerizācija un stabilitāte ietekmē želeju, šķīdumi, kas satur 100 mg/ml NT, tika kontrolēti pie pH 8, 7 un 6, izmantojot flakona inversijas testu.NT paraugi, kas inkubēti pie pH 8 un 7, saželēja pēc 30 minūtēm 37 °C temperatūrā, bet gēls ar pH 8 palika dzidrs, savukārt gēls ar pH 7 uzrādīja redzamas nogulsnes (5.a att.).Turpretim šķīdums, kas satur HT pie pH 6, neveido želeju, un pēc 20 minūtēm 37 ° C temperatūrā varēja redzēt lielas nogulsnes.Tas liecina, ka paši dimēri un/vai to augstākā stabilitāte, salīdzinot ar monomēriem, novērš želeju.NT nogulšņu veidošanās pie pH 7 un 6 nebija gaidāma, jo ir ziņots, ka NT šķīst pie 200 mg/ml27, viegli pārlocās pēc termiskās denaturācijas, kā arī saglabā α-spirāli pie zemākām vērtībām. pH 18. Šo neatbilstību iespējamais izskaidrojums ir tāds, ka iepriekš ziņotie eksperimenti tika veikti istabas temperatūrā vai zemāk vai salīdzinoši zemā olbaltumvielu koncentrācijā16, 18, 19.
NT flakona inversijas tests (100 mg/mL) pie pH 8, 7, 6 un 154 mM NaCl (pH 8) pēc inkubācijas 37°C temperatūrā.b NT CD spektri ar un bez attiecīgi 154 mM NaF un 154 mM NaCl.Molārā eliptitāte pie 222 nm tiek pārvērsta dabisko kroku proporcijā.c NT inversijas tests (100 mg/ml) NT* (37 °C un 60 °C), NTA72R (37 °C) un His-NT-L6 (37 °C un 60 °C).d NT mutantu NT*, NTA72R un His-NT-L6 CD spektri.Molārā eliptitāte pie 222 nm tiek pārvērsta dabisko kroku proporcijā.e NTFlSp, NTMiSp un reducētā NTMiSp (100 mg/ml) inversijas tests.Mēroga josla 5 mm.f NT, NTFlSp, NTMiSp un reducētās NTMiSp CD spektri.Molārā eliptitāte pie 222 nm tiek pārvērsta dabisko kroku proporcijā.Pilni NT spektri 25 ° C un 95 ° C temperatūrā ir parādīti 8. papildu attēlā.
Fizioloģiskā sāls koncentrācija nosaka elektrostatisko mijiedarbību starp NT apakšvienībām un NT pārneses dimerizāciju līdz zemākam pH18.Mēs atklājām, ka 154 mM NaCl un NaF klātbūtne patiešām kavē želeju, attiecīgi (5.a, b. att.; Papildu 2.b att.) un ka šie sāļi palielināja NT monomēru termisko stabilitāti (5.b att., 8. papildu att.). .Tas arī liecina, ka stabilitātes uzlabošana, nevis dimerizācija, novērš želejas veidošanos.
Lai turpinātu izpētīt proteīna dimerizācijas un stabilitātes lomu želēšanā, mēs izmantojām divus mutantus, NT * un NTA72R, kas arī paliek monomēri pie zema pH 28, 30.NT* ir dubultā lādiņa apvērsuma mutants, kurā monomēra šķietamais dipolārā lādiņa sadalījums ir saplacināts, kas novērš dimerizāciju un krasi palielina monomēra stabilitāti.NTA72R ir uzlādēts dipols, bet ar Arg aizvietotā Ala atrodas pie dimēra robežas, tāpēc mutācijas traucē dimerizācijai nepieciešamo apakšvienību mijiedarbību.Inkubējot 37°C temperatūrā, NT* neveidoja hidrogēlu, savukārt NTA72R veidoja necaurspīdīgu želeju 15 minūtes (5.c att.).Tā kā gan NT*, gan NTA72R nevar dimerizēties, bet atšķiras monomēra stabilitātē (5.d attēls), šie rezultāti liecina, ka augsta termodinamiskā stabilitāte neļauj NT saželēt.To apstiprina arī fakts, ka HT* veido želeju, ja tas ir nestabils augstā temperatūrā (pēc 8 min 60°C; 5.c att.).Iepriekš tika pierādīts, ka augstais metionīna saturs NT sašķidrina tā dabisko locīšanu un ka seši Met uz Leu aizstājēji (šeit saukti par His-NT-L6) spēcīgi stabilizē NT46 monomēru.Pamatojoties uz pieņēmumu, ka NT gēla veidošanai ir nepieciešama strukturāla elastība, mēs noskaidrojām, ka His-NT-L6 stabilais mutants nesaželēja 37 ° C temperatūrā (5.c, d attēls).Tomēr His-NT-L6 arī veidoja želeju pēc inkubācijas 60°С 60 minūtes (5.c attēls).
Šķiet, ka NT spēja pārveidoties par β-loksnes struktūrām un veidot hidrogēlus attiecas uz dažiem, bet ne visiem spidroīna NT domēniem.NT no dažādiem zīda veidiem un zirnekļu sugām, Trichonephila clavipes (NTFlSp), veidoja želejas, neskatoties uz to salīdzinoši zemo metionīna saturu un augsto termisko stabilitāti (5.e, f attēls un 2. papildu tabula).Turpretim NT no mazā ampulāra proteīna spidroīna no Araneus ventricosus (NTMiSp) ar zemu termisko stabilitāti un augstu metionīna saturu neveido hidrogēlus (2. papildu tabula un 5.e, f attēls).Pēdējais var būt saistīts ar intramolekulāro disulfīda saišu klātbūtni 29, 47.Konsekventi, kad NTMiSp disulfīda saites tika reducētas, pēc 10 minūšu inkubācijas 37 °C temperatūrā tas veidoja hidrogēlu (5.e att.).Noslēgumā jāatzīmē, ka strukturālā elastība ir svarīgs, bet ne vienīgais kritērijs gēla veidošanai no NT.Vēl viens faktors, kas varētu būt būtisks, ir tieksme veidot amiloīda fibrilus, un analīze ar rāvējslēdzēja datubāzi un Waltz algoritmu parādīja korelāciju starp spēju veidot želejas un amiloidogēno reģionu klātbūtni, kā arī prognozēto reģionu apjomu. lai veidotu steriskus rāvējslēdzējus.Bija korelācija (2. papildu tabula un 9. papildu attēls).
NT spēja veidot fibrillas un veidot želejas labvēlīgos apstākļos lika mums izvirzīt hipotēzi, ka NT saplūšana ar citiem proteīna fragmentiem joprojām var veidot želejas ar pilnu saplūšanas partneru funkciju.Lai to pārbaudītu, mēs ieviesām zaļo fluorescējošo proteīnu (GFP) un purīna nukleozīdu fosforilāzi (PNP) attiecīgi NT C-galā.Iegūtie saplūšanas proteīni tika ekspresēti E. coli ar ļoti augstu gala iznākumu (attiecīgi 150 mg/l un 256 mg/l kratīšanas kolbu kultūras His-NT-GFP un His-NT-PNP), kas atbilst tam, kas ir parādīts. citiem proteīniem, kas sapludināti ar NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) un His-NT-PNP (100mg/ml) saplūsmes proteīni veidoja želejas pēc 2 stundām un 6,5 stundām 37°C temperatūrā, un, kas ir svarīgi, GFP frakcija palika nemainīga.novēroja pēc želejas, ar >70% no sākotnējās fluorescences intensitātes, kas paliek pēc želejas (6.a attēls).Lai izmērītu PNP aktivitāti his-NT-PNP šķīdumos un gēlos, mums bija jāatšķaida saplūšanas proteīns ar NT, jo tīra preparāta fermentatīvā aktivitāte bija ārpus testa noteikšanas diapazona želejas koncentrācijās.Gēls, kas izveidots ar maisījumu, kas satur 0,01 mg/ml His-NT-PNP un 100 mg/mL NT, saglabāja 65% no iepriekš inkubēto paraugu sākotnējās fermentatīvās aktivitātes (6.b attēls).Mērīšanas laikā gēls palika neskarts (papildu 10. attēls).
Relatīvā fluorescences intensitāte pirms un pēc His-NT-GFP (300 mg / ml) un apgrieztā flakona, kas satur His-NT-GFP hidrogelu (300 mg / ml) želejas, redzamā un UV gaismā.Punkti parāda atsevišķus mērījumus (n = 3), kļūdu joslas parāda standarta novirzi.Vidējā vērtība ir parādīta kļūdu joslu centrā.b PNP aktivitāte tika iegūta ar fluorometrisko analīzi, izmantojot šķīdumus un želejas, kas sastāv no NT (100 mg/ml) un maisījuma, kas satur 0,01 mg/ml his-NT-PNP un 100 mg/ml Jaunās Taivānas dolārus.Ieliktnē ir redzams apgriezts flakons, kurā ir hidrogēls, kas satur His-NT-PNP (5 mm mēroga josla).
Šeit mēs ziņojam par hidrogēlu veidošanos no NT un citiem rekombinantiem spidroīna proteīniem, inkubējot proteīna šķīdumu 37 ° C temperatūrā (1. attēls).Mēs parādām, ka želeja ir saistīta ar α-spirāles transformāciju β-slāņos un amiloīda veida fibrilu veidošanos (3. un 4. att.).Šis atklājums ir pārsteidzošs, jo NT ir satīti lodveida piecu spirāles kūļi, kas pazīstami ar savu ārkārtīgi augsto šķīdību un augstu stabilitāti koncentrācijās >200 mg/ml 4 °C temperatūrā vairākas dienas27.Turklāt NT viegli salokās pēc termiskās denaturācijas pie zemām olbaltumvielu koncentrācijām µM.Saskaņā ar mūsu rezultātiem fibrilu veidošanai nepieciešama >10 mg/mL proteīna koncentrācijas un nedaudz paaugstinātas temperatūras kombinācija (1. att.).Tas atbilst idejai, ka amiloīda fibrillas var veidoties no globulāri salocītām olbaltumvielām, kas ir daļēji nesalocītā stāvoklī termisko svārstību dēļ fizioloģiskos apstākļos 48 .Proteīnu piemēri, kas tiek pārveidoti, ir insulīns49,50, β2-mikroglobulīns, transtiretīns un lizocīms51,52,53.Lai gan NT ir α-spirāle savā dabiskajā stāvoklī, aptuveni 65% polipeptīdu ķēdes ir savietojami ar steriskā rāvējslēdzēja veidošanos (4.e attēls) 45 .Tā kā monomērs ir dinamiski mobils46, tas var pakļaut šos potenciālos amiloidogēnos reģionus mēreni paaugstinātā temperatūrā, un augstā kopējā proteīna koncentrācijā var sasniegt kritisko koncentrāciju amiloīda fibrilu veidošanai54.Ievērojot šo argumentāciju, mēs atklājām negatīvu korelāciju starp spidroīna koncentrāciju un želejas laiku (1.c att.), un, ja monomēra NT konformācija tiek stabilizēta ar mutācijām (NT*, His-NT-L6) vai pievienojot sāļus, var novērst veidošanās hidrogēliem (5. att.).
Vairumā gadījumu amiloīda fibrillas pazūd no šķīduma kā nogulsnes, bet noteiktos apstākļos tās var veidot hidrogēlus55,56,57.Hidrogēlu veidojošajām fibrilām parasti ir augsta malu attiecība, un tās veido stabilus trīsdimensiju tīklus, izmantojot molekulāro sapīšanu, 55, 58, kas atbilst mūsu rezultātiem.Hidrogēla veidošanai in vitro olbaltumvielas bieži tiek pilnībā vai daļēji izlocītas, piemēram, pakļaujot organiskajiem šķīdinātājiem, augstā temperatūrā (70–90 °C) un/vai zemā pH (1,5–3,0)59, 60, 61, 62.Šeit aprakstītajiem spidroīna hidrogēliem nav nepieciešama smaga apstrāde, kā arī nav nepieciešami šķērssaistošie līdzekļi, lai stabilizētu hidrogēlus.
Iepriekš tika ziņots, ka spidroīna atkārtojumi un QD, kas, šķiet, tiek pakļauti β-loksnes pārslēgšanai zīda vērpšanas laikā, veido hidrogelus.Salīdzinot ar mūsu konstatējumiem, inkubācijas laiki un/vai inkubācijas temperatūra bija attiecīgi ievērojami garāki vai augstāki, un iegūtie hidrogēli bieži bija necaurspīdīgi (7. attēls un 1. papildu tabula) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Papildus ātrajiem sacietēšanas laikiem NT hidrogēli >300 mg/ml (30%) pārspēja visus citus aprakstītos rekombinantos zirnekļa zīda proteīna hidrogēlus, kā arī dabiskos hidrogēlus, piemēram, želatīnu, alginātu (2%), agaru (0,5%). ) un kolagēnu.(0,6%) (7. attēls un 1. un 3. papildu tabula)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Hidrogēlu želejas laiks un elastības modulis šajā pētījumā tika salīdzināti ar citiem spidroīna bāzes hidrogēliem un atlasītajiem dabiskajiem hidrogēliem.Atsauces ir sniegtas kopā ar želejas apstākļu aprakstu.APS Amonija persulfāts, istabas temperatūra.Dati 37., 38., 39., 64., 65., 66., 67., 68., 69., 70., 71., 72., 73., 74.
Šķiet, ka zirnekļi ir izstrādājuši veidus, kā novērst spidroīna želeju uzglabāšanas laikā.Neskatoties uz augsto proteīna koncentrāciju zīda dziedzerī, lielais atkārtošanās reģions, kas saistīts ar terminālo domēnu, nozīmē, ka šķietamā NT un CT koncentrācija dziedzerī atbilst aptuveni 10-20 mg/ml šī pētījuma robežās.nepieciešama in vitro novērotai hidrogēla veidošanai.Turklāt līdzīgas sāļu koncentrācijas 16 stabilizēja NT, kā zīda dziedzeros (5.b att.).NT konformācija ir pētīta E. coli citozolā un konstatēts, ka tā ir ciešāk salocīta nekā izmeklējot in vitro, vēl vairāk norādot, ka sāls vai citi faktori kavē tās agregāciju in vivo.Tomēr NT spēja pārveidoties par β-loksnes fibrilām var būt svarīga kvēldiega veidošanā, un tā ir jāizpēta turpmākajos pētījumos.
Papildus šajā pētījumā novērotajiem jaunajiem NT-amiloīda veida fibrilu un hidrogēla veidošanās aspektiem mēs arī parādām, ka šai parādībai var būt biotehnoloģiski un biomedicīnas pielietojumi (8. att.).Kā koncepcijas pierādījumu mēs apvienojām NT ar GFP vai PNP un parādījām, ka sapludinātais proteīns arī veido hidrogēlus, kad to inkubē 37 ° C temperatūrā, un ka GFP un PNP frakcijas lielākoties saglabā savu aktivitāti pēc želejas (6. attēls).Nukleozīdu fosforilāzes ir svarīgi nukleozīdu analogu75 sintēzes katalizatori, kas padara mūsu atklājumu nozīmīgu biofarmācijas nozarei.Koncepcija par sapludināto proteīnu ekspresiju, kas veido caurspīdīgus hidrogēlus labvēlīgos apstākļos, ļauj izveidot funkcionalizētus hidrogēlus ar labvēlīgām īpašībām plašam lietojumu klāstam, piemēram, enzīmu imobilizācijai, kontrolētai zāļu izdalīšanai un audu inženierijai.Turklāt NT un NT* ir efektīvi ekspresijas marķieri30, kas nozīmē, ka NT un tā variantus var izmantot augstas caurlaidības šķīstošo saplūšanas proteīnu ražošanai un sekojošai imobilizētu mērķa proteīnu izveidei 3D hidrogēlos.
NT ir šķīstošs, α-spirālveida un stabils zemās koncentrācijās (µM) un 37°C.Tajā pašā temperatūrā, bet pieaugošā koncentrācijā (>10 mg/ml), NT veido želejas, kas sastāv no amiloīdiem līdzīgām fibrilām.NT saplūšanas proteīni veido arī fibrilārus gēlus ar pilnībā funkcionāliem saplūšanas fragmentiem, ļaujot dažādus proteīnus imobilizēt 3D hidrogēlos, izmantojot NT.Apakšā: NT (PDB: 4FBS) un šķiedru tīklu un saistīto proteīnu struktūru ilustrācijas (pieņemts un nav veidots mērogā, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdpdbR).
Konstrukcijas (pilnu sarakstu, ieskaitot aminoskābju sekvences, skatiet 4. papildu tabulā) tika klonētas plazmīdā pT7 un pārveidotas E. coli BL21 (DE3).E. coli saturošas inženierijas plazmīdas inokulēja Luria buljonā, kas papildināts ar kanamicīnu (70 mg/l), un audzēja nakti 30°C un 250 apgr./min.Pēc tam kultūra tika inokulēta 1/100 LB barotnē, kas satur kanamicīnu, un kultivēja 30 ° C un 110 apgr./min, līdz OD600 sasniedza 0, 8.KMR pētījumiem baktērijas tika audzētas M9 minimālajā barotnē, kas satur 2 g D-glikozes 13C (Aldrich) un 1 g amonija hlorīda 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) proteīnu marķēšanai ar izotopiem.Pazeminiet temperatūru līdz 20 grādiem pēc Celsija un inducējiet olbaltumvielu ekspresiju ar 0,15 mM izopropiltiogalaktopiranozīdu (galīgā koncentrācija).Pēc olbaltumvielu ekspresijas uz nakti šūnas tika novāktas ar ātrumu 7278 × g, 4 ° C 20 minūtes.Šūnu granulas tika atkārtoti suspendētas 20 mM Tris-HCl, pH 8, un sasaldētas līdz turpmākai lietošanai.Atkausētās šūnas tika lizētas, izmantojot šūnu disruptoru (TS sērijas iekārtas, Constant Systems Limited, Anglija) pie 30 kPa.Pēc tam lizātus centrifugēja pie 25 000 g 30 minūtes 4 ° C temperatūrā.NTMiSp granulu pēc tam atkārtoti suspendēja 2 M urīnvielā, 20 mM Tris-HCl, pH 8, un 2 minūtes apstrādāja ar ultraskaņu (2 s ieslēgts/izslēgts, 65%), pēc tam vēlreiz centrifugēja pie 25 000 xg, 4 ° C. 30 min.Supernatants tika ievietots Ni-NTA kolonnā, mazgāts ar 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazolu, pH 8, un visbeidzot proteīns tika eluēts ar 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazolu, pH 8. Lai izveidotu NT2RepCT un NTCT, trombīna gremošana ievada vietu (ThrCleav) starp His un NT.Trombīna šķelšanās vietas atrodas arī His-NT-ThrCleav-2Rep (ražo 2Rep), His-tioredoksīns-ThrCleav-NT (ražo NT), His-tioredoksīns-ThrCleav-CT (ražo CT), His-tioredoksīns-NTThrCleav. .* (ražo NT*), His-Tioredoksīns-ThrCleav-NTA72R (ražo NTA72R), His-Tioredoksīns-ThrCleav-NTFlSp (ražo NTF1Sp) un His-Sēra redoksīns-ThrCleav-NTMiSp (ražo NTMiSp).Konstrukcijas tika sagremotas ar trombīnu (1:1000) un nakti dializētas 4°C temperatūrā ar 20 mM Tris-HCl, pH 8, izmantojot Spectra/Por dialīzes membrānu ar molekulmasas slieksni 6-8 kDa.Pēc dialīzes šķīdumu ievieto Ni-NTA kolonnā un savāc notekūdeņus, kas satur interesējošo proteīnu.Olbaltumvielu koncentrācijas tika noteiktas, mērot UV absorbciju pie 280 nm, izmantojot katra proteīna ekstinkcijas koeficientu, izņemot NTF1Sp, kas izmantoja Bredforda testu saskaņā ar ražotāja protokolu.Tīrība tika noteikta ar SDS poliakrilamīda (4–20%) gēla elektroforēzi un Coomassie izcili zilo krāsošanu.Olbaltumvielas tika koncentrētas, izmantojot centrifūgas filtrus (VivaSpin 20, GE Healthcare) pie 4000 xg ar 10 kDa molekulmasas robežu 20 minūšu ciklos.
Atkausējiet proteīna šķīdumu un uzmanīgi pipetē 150 µl 1 ml caurspīdīgā starpsienas flakonā (8 x 40 mm Thermo Scientific).Caurules tika aizvērtas un noslēgtas ar parafilmu, lai novērstu iztvaikošanu.Paraugus (n = 3) inkubēja 37 ° C vai 60 ° C temperatūrā un periodiski apgrieza, lai novērotu želeju.Paraugus, kas nesaželēja, inkubēja vismaz vienu nedēļu.Samaziniet NTMiSp disulfīda saites ar 10 mM DTT uz 10 µM proteīna.Lai analizētu dabisko zirnekļa zīda pārklājumu želeju, tika sagriezts Zviedrijas tilta zirneklis, divi galvenie ampulētie dziedzeri tika ievietoti 200 μl 20 mM Tris-HCl buferšķīdumā pH 8 un sagriezti, lai ļautu pārklājumam atdalīties no dziedzeriem..Dziedzeru saturu izšķīdina buferšķīdumā, 50 µl sausas masas noteikšanai (atvērtus flakonus inkubējot 60 °C temperatūrā līdz konstantam svaram) un 150 µl želēšanai 37 °C temperatūrā.
Mērīšanas ģeometrija/instruments ir izgatavots no nerūsējošā tērauda, ​​izmantojot paralēlu plāksni ar augšējo diametru 20 mm un atstarpi 0,5 mm.Karsējiet paraugu no 25 °C līdz 45 °C un atpakaļ līdz 25 °C ar ātrumu 1 °C minūtē, izmantojot nerūsējošā tērauda apakšējo Peltjē plāksni.Vibrācijas mērījumi tika veikti ar frekvenci 0, 1 Hz un materiāla lineārajā viskoelastīgajā reģionā pie deformācijas 5% un 0, 5% paraugiem attiecīgi 100 mg / ml un 300–500 mg / ml.Izmantojiet pielāgotu mitruma kameru, lai novērstu iztvaikošanu.Dati tika analizēti, izmantojot Prism 9.
Infrasarkano (IS) spektru savākšanai istabas temperatūrā no 800 līdz 3900 cm–1.ATR ierīce, kā arī gaismas ceļš caur spektrometru tiek iztīrīts ar sausu filtrētu gaisu pirms eksperimenta un tā laikā.Šķīdumi (500 mg / ml, lai samazinātu ūdens absorbcijas maksimumus spektros) tika pipeti uz kristāliem, un pirms mērīšanas tika izveidoti gēli (500 mg / ml) un pēc tam pārnesti uz kristāliem (n = 3).Tika reģistrēti 1000 skenējumi ar izšķirtspēju 2 cm-1 un nulles darba ciklu 2. Otrais atvasinājums tika aprēķināts, izmantojot OPUS (Bruker), izmantojot deviņu punktu izlīdzināšanas diapazonu.Spektri tika normalizēti uz to pašu integrācijas apgabalu starp 1720 un 1580 cm-1, izmantojot F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.ATR-IR spektroskopijā infrasarkanā stara iespiešanās dziļums paraugā ir atkarīgs no viļņu skaita, kā rezultātā tiek panākta spēcīgāka absorbcija pie zemākiem viļņu skaitļiem nekā pie lielākiem viļņu skaitļiem.Šie efekti nav koriģēti spektriem, kas parādīti 1.3, jo tie ir ļoti mazi (papildu 4. attēls).Koriģētie spektri šim skaitlim tika aprēķināti, izmantojot Bruker OPUS programmatūru.
Principā proteīnu konformāciju visaptveroša kvantitatīva noteikšana ir iespējama pēc uzticamas komponentu dekonvolācijas amīda I pīķa ietvaros.Tomēr praksē rodas daži šķēršļi.Dekonvolūcijas laikā spektra troksnis var parādīties kā (viltus) maksimumi.Turklāt maksimums ūdens liekšanas dēļ sakrīt ar amīda I pīķa pozīciju, un paraugiem, kas satur lielu daudzumu ūdens, piemēram, šeit pētītajam ūdens gēlam, var būt līdzīgs lielums.Tāpēc mēs nemēģinājām pilnībā sadalīt amīda I maksimumu, un mūsu novērojumi jāņem vērā tikai citu metožu, piemēram, NMR spektroskopijas, atbalstam.
50 mg / ml NT un His-NT2RepCT šķīdumi tika saželēti nakti 37 ° C temperatūrā.Pēc tam hidrogēlu atšķaidīja ar 20 mM Tris-HCl (pH 8) līdz koncentrācijai 12,5 mg/ml, labi sakrata un pipetē, lai sadalītu želeju.Pēc tam hidrogēlu 10 reizes atšķaida ar 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl parauga uzklāja uz vara režģa, kas pārklāts ar formvaru, un lieko paraugu noņēma ar blotēšanas papīru.Paraugus divreiz mazgā ar 5 µl MilliQ ūdens un 5 minūtes krāsoja ar 1% uranilformiātu.Noņemiet lieko traipu ar absorbējošu papīru, pēc tam nosusiniet sietu gaisā.Šajos režģos tika veikta attēlveidošana, izmantojot FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, kas darbojās pie 100 kV.Attēli tika ierakstīti ar x 26 500 un x 43 000 palielinājumu, izmantojot Veleta 2k × 2k CCD kameru (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Minstere, Vācija).Katram paraugam (n = 1) tika ierakstīti 10–15 attēli.ImageJ (//imagej.nih.gov/) tika izmantots attēlu analīzei un šķiedru diametra mērīšanai (n = 100, dažādas šķiedras).Prism 9 tika izmantota, lai veiktu nesapārotus t-testus (divu zaru).Vidējās His-NT2RepCT un NT fibrila bija attiecīgi 11,43 (SD 2,035) un 7,67 (SD 1,389) nm.Uzticamības intervāls (95%) ir no -4,246 līdz -3,275.brīvības pakāpes = 198, p < 0,0001.
80 µl šķidro paraugu, kas satur 10 µM tioflavīna T (ThT), tika izmērīti trīs eksemplāros (n = 3) statiskos apstākļos, izmantojot Corning 96 bedrīšu melnā dibena caurspīdīgas dibena plāksnes (Corning Glass 3881, ASV).Fluorescences atšķirības tika reģistrētas, izmantojot 440 nm ierosmes filtru un 480 nm emisijas filtru (FLUOStar Galaxy no BMG Labtech, Offenburga, Vācija).ThT signāls nebija ne piesātināts, ne dzēsts, jo eksperimenti ar dažādām ThT koncentrācijām tika veikti, nemainot signāla intensitāti.Reģistrē absorbciju pie 360 ​​nm dūmakas mērīšanai.Sēšanas eksperimentiem 37 ° C temperatūrā izveidoja 100 mg/ml gēlus, atkārtoti suspendēja un izmantoja sēšanai ar molārām attiecībām 5%, 10% un 20%.Dati tika analizēti, izmantojot Prism 9.
His-NT2RepCT un NT >100 mg/ml izejvielas atkausē uz ledus un filtrē caur 0,22 µm filtru.Koncentrācijas tika aprēķinātas, mērot absorbciju pie 280 nm, izmantojot Nanodrop.96 bedrīšu melnas nesaistošās plāksnes (Corning) iedobēs ar skaidru dibenu paraugus atšķaida līdz 20 mg/ml 20 mM Tris-HCl pH 8 un sajauca ar 5 μM ThT (galīgā koncentrācija), kopējā parauga koncentrācija. 50 μl tilpums.Paraugi tika attēloti ik pēc 10 minūtēm 37 ° C temperatūrā CellObserver (Zeiss) mikroskopā ar pārraidītās gaismas kanālu un FITC ierosmes un emisijas filtru komplektiem ThT attēlveidošanai.Attēlveidošanai tiek izmantots 20x/0,4 objektīvs.Attēlu analīzei tika izmantoti Zen Blue (Zeiss) un ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Gēli tika sagatavoti arī no NT un His-NT2RepCT šķīdumiem ar koncentrāciju 50 mg / ml, kas satur 20 mM Tris pH 8 un 5 µM ThT, un inkubēja 37 ° C temperatūrā 90 minūtes.Gela gabaliņi tika pārnesti uz jaunu iedobi, kas satur 20 mM Tris, pH 8 un 5 μM ThT, nesaistošā melnā 96 iedobju caurspīdīgā apakšējā plāksnē.Iegūstiet zaļas fluorescences un spilgtu lauka attēlus ar palielinājumu 20x/0,4.ImageJ tika izmantots attēlu analīzei.
Šķīduma NMR spektri tika iegūti pie 310 K ar 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometru, kas aprīkots ar QCI kvadrupole rezonanses impulsa gradienta lauka kriozondi (HFCN).KMR paraugi, kas satur 10 mg/ml homogēna proteīna, kas iezīmēts ar 13C, 15N, izšķīdināts 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .NT2RepCT ķīmiskās nobīdes pie pH 6,7 tika izmantotas, lai piešķirtu maksimumu 23 15N-HSQC 2D spektrā.
13C, 15N iezīmētu hidrogēlu maģiskā leņķa vērpšanas cieto KMR (MAS) spektri tika reģistrēti ar Bruker Avance III HD spektrometru 800 MHz, kas aprīkots ar 3,2 mm 13C/15N{1H} bezelektronu zondi.Parauga temperatūra tika kontrolēta, izmantojot mainīgas temperatūras gāzes plūsmu pie 277 K. Divdimensiju dipola rotācijas rezonanses (DARR)76 un radiofrekvences atkārtotas savienošanas (RFDR)77 spektri tika iegūti attiecīgi pie MAS frekvencēm 12,5 kHz un 20 kHz.Šķērspolarizācija (CP) no 1H līdz 13C tika veikta, izmantojot lineāro rampu no 60,0 līdz 48,0 kHz pie 1H, 61,3/71,6 kHz pie 13C (pie 12,5/20 kHz MAS) un kontakta laiku 0,5–1 ms.Datu vākšanas laikā tika izmantota Spinal6478 atsaiste pie 73, 5 kHz.Iegūšanas laiks bija 10 milisekundes, un cikla aizkave bija 2,5 sekundes.RFDR spektros novērotās atsevišķi saistītās Cα / Cβ korelācijas tika piešķirtas, pamatojoties uz raksturīgajām atlieku tipa ķīmiskajām nobīdēm un daudzkārt saistītām korelācijām DARR spektros.
Zipper79 datubāze (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) tika izmantota, lai novērtētu plandīšanās tendences un Rosetta enerģiju NT, NTFlSp un NTMiSp.Zipper datu bāze aprēķina Rosetta Energy80, kas apvieno vairākas bezmaksas enerģijas funkcijas, lai modelētu un analizētu olbaltumvielu struktūru.Enerģijas līmenis -23 kcal/mol vai zemāks norāda uz augstu fibrilācijas tendenci.Zemāka enerģija nozīmē lielāku divu β-virkņu stabilitāti rāvējslēdzēja konformācijā.Turklāt Waltz algoritms tika izmantots, lai prognozētu amiloidogēnos reģionus NT, NTFlSp un NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT proteīna šķīdumu sajauca ar 2-(N-morfolino)etānsulfonskābes (MES) buferšķīdumu pie pH 5,5 un 6,0, lai pazeminātu pH attiecīgi līdz pH 6 un 7.Galīgā proteīna koncentrācija bija 100 mg/ml.
Mērījumi tika veikti ar J-1500 CD spektrometru (JASCO, ASV), izmantojot 300 μL kiveti ar optisko ceļu 0, 1 cm.Olbaltumvielas tika atšķaidītas līdz 10 μM (n = 1) 20 mM fosfāta buferšķīdumā (pH 8).Lai analizētu olbaltumvielu stabilitāti sāls klātbūtnē, olbaltumvielas tika analizētas tādā pašā koncentrācijā (n = 1) 20 mM fosfāta buferšķīdumā (pH 8), kas satur attiecīgi 154 mM NaF vai NaCl.Temperatūras skenēšana tika reģistrēta pie 222 nm no 25 ° C līdz 95 ° C ar sildīšanas ātrumu 1 ° C / min.Dabiski salocītu proteīnu īpatsvars tika aprēķināts, izmantojot formulu (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Turklāt katram paraugam tika reģistrēti pieci spektri no 260 nm līdz 190 nm 25 ° C temperatūrā un pēc karsēšanas līdz 95 ° C.Pieci spektri tika aprēķināti vidēji, izlīdzināti un pārvērsti molārajā eliptitātē.Dati tika analizēti, izmantojot Prism 9.
His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µL) fluorescences intensitāte tika mērīta trīs eksemplāros (n = 3) 96 iedobju Corning plāksnēs ar melnu caurspīdīgu dibenu (Corning Glass 3881, ASV) statiskos apstākļos.Izmēra paraugus ar fluorescences plākšņu lasītāju ar ierosmes viļņa garumu 395 nm un reģistrē emisiju pie 509 nm pirms želejas un 2 stundas vēlāk 37 °C temperatūrā.Dati tika analizēti ar Prism 9.
Purīna nukleozīdu fosforilāzes aktivitātes noteikšanas komplekts (fluorometriskā metode, Sigma Aldrich) tika izmantots saskaņā ar ražotāja norādījumiem.Lai izmērītu aktivitāti gēlos un šķīdumos, kas satur His-NT-PNP, samaisiet 10 ng His-NT-PNP ar 100 mg/mL NT līdz kopējam tilpumam 2 µL, jo gēls deva signālu virs komplekta noteikšanas intervāla.Tika iekļautas kontroles gēliem un šķīdumiem bez His-NT-PNP.Mērījumi tika veikti divas reizes (n = 2).Pēc aktivitātes mērīšanas reakcijas maisījums tika noņemts un gēls nofotografēts, lai nodrošinātu, ka gēls mērījuma laikā paliek neskarts.Dati tika analizēti, izmantojot Prism 9.
Lai iegūtu papildinformāciju par studiju plānošanu, skatiet dabas pētījumu kopsavilkumu, kas ir saistīts ar šo rakstu.
1. un 2. attēlā parādīti sākotnējie dati.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f un 6, papildu attēli.3, papildu att.5a, d, papildu att.6 un papildu att.8. Dati Dati no šī pētījuma ir mitināti Zenodo datubāzē https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Šajā pētījumā iegūtie KMR dati tika ievietoti BMRBig repozitorijā ar ieraksta ID bmrbig36.GFP un PNP struktūras tika ņemtas no PBP (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. un Johansson, J. Mākslīgā zirnekļa zīda vērpšana.Nacionālā ķīmija.bioloģija.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes genoms izceļ zirnekļa zīda gēnu daudzveidību un to sarežģīto izpausmi.Nacionālā Dženeta.49, 895–903 (2017).