347 12,7 * 1,24 mm nerūsējošā tērauda tinuma caurules, sinhronas elektrostatiskās kondensācijas un α-sinukleīna un tau koagregācijas molekulārais mehānisms

Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Turklāt, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs rādām vietni bez stiliem un JavaScript.
Slīdņi, kas parāda trīs rakstus katrā slaidā.Izmantojiet pogas Atpakaļ un Nākamais, lai pārvietotos pa slaidiem, vai slaidu kontrollera pogas beigās, lai pārvietotos pa katru slaidu.

347 nerūsējošā tērauda cauruļu specifikācija

347 12.7*1.24mm Nerūsējošā tērauda tinuma caurules

Ārējais diametrs: 6,00 mm OD līdz 914,4 mm OD, Izmēri līdz 24” NB pieejams Ex-stock, OD izmērs Tērauda caurules pieejamas Ex-stock

SS 347 cauruļu biezuma diapazons: 0,3–50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S utt. (0,5–12 mm) vai neparasts izmērs, kas jāpielāgo pēc vajadzības

Tips: SS 347 bezšuvju caurules |SS 347 ERW caurules |SS 347 metinātās caurules |SS 347 izgatavotas caurules |SS 347 CDW caurules, LSAW caurules / šuves metinātas / pārvilktas

Forma: SS 347 apaļas caurules/caurules, SS 347 kvadrātveida caurules/caurules, SS 347 taisnstūra caurule/caurules, SS 347 tintes caurules, SS 347 “U” forma, SS 347 pannas kūku spoles, SS 347 hidrauliskās caurules

Garums: viens nejaušs, dubults nejaušs un vajadzīgā garuma gals: gluds gals, slīps gals, protektors

Gala aizsardzība: plastmasas vāciņi |Ārējā apdare: 2B, Nr.4, Nr.1, Nr.8 Spoguļa apdare nerūsējošā tērauda caurulēm, apdare atbilstoši klienta prasībām

Piegādes stāvoklis: rūdīts un marinēts, pulēts, spilgti rūdīts, auksti stiepts

Pārbaude, testu ziņojumi: dzirnavu testu sertifikāti, EN 10204 3.1, ķīmisko vielu ziņojumi, mehāniskie ziņojumi, PMI testu ziņojumi, vizuālās pārbaudes ziņojumi, trešās puses pārbaudes ziņojumi, NABL apstiprinātie laboratorijas ziņojumi, destruktīvo testu ziņojumi, nesagraujošo testu ziņojumi

Iepakojums: iesaiņots koka kastēs, plastmasas maisiņos, tērauda sloksnēs komplektā vai pēc klientu pieprasījuma

Īpašie piedāvājumi: pēc pieprasījuma var izgatavot citus izmērus un specifikācijas

SS 347 cauruļu izmēru diapazons: 1/2 collas NB, OD līdz 24 collas

ASTM A312 347: bezšuvju un taisnu šuvju metināta austenīta caurule, kas paredzēta augstām temperatūrām un vispārējai korozijai.Metināšanas laikā nav atļauts izmantot pildvielu.

ASTM A358 347: elektriski kausēta metināta austenīta caurule korozijas un/vai augstas temperatūras lietošanai.Parasti saskaņā ar šo specifikāciju tiek ražotas tikai caurules līdz 8 collām.Metināšanas laikā ir atļauts pievienot pildvielu.

ASTM A790 347: bezšuvju un taisnu šuvju metināta ferīta/austenīta (dupleksa) caurule, kas paredzēta vispārējai korozijai, īpaši uzsverot izturību pret sprieguma korozijas plaisāšanu.

ASTM A409 347: Taisnas šuves vai spirālveida šuves elektriski kausēta liela diametra austenīta gaismas sienas caurule ar izmēriem 14” līdz 30” ar sienām Sch5S un Sch 10S korozīvām un/vai augstām

ASTM A376 347: bezšuvju austenīta caurule lietošanai augstā temperatūrā.

ASTM A813 347: vienas šuves, vienas vai dubultmetinātas austenīta caurules augstām temperatūrām un vispārējai korozijai.

ASTM A814 347: auksti apstrādāta metināta austenīta caurule augstām temperatūrām un vispārējai korozijai.

347H nerūsējošā tērauda caurules Ķīmiskais sastāvs

Nerūsējošā tērauda 347H cauruļu mehāniskās īpašības

Nerūsējošā tērauda 347H cauruļu fiziskās īpašības

Līdzvērtīgas kategorijas 347H nerūsējošā tērauda caurulei

Amiloīda alfa-sinukleīna (αS) agregācija ir Parkinsona slimības un citu sinukleinopātijas pazīme.Nesen tau proteīns, kas parasti saistīts ar Alcheimera slimību, ir saistīts ar αS patoloģiju un konstatēts, ka tas vienlaikus lokalizējas αS bagātos ieslēgumos, lai gan abu proteīnu koagregācijas molekulārais mehānisms joprojām nav skaidrs.Šeit mēs ziņojam, ka αS fāze sadalās šķidros kondensātos, izmantojot elektrostatisko komplekso kondensāciju ar pozitīvi lādētiem polipeptīdiem, piemēram, tau.Atkarībā no αS afinitātes pret polikationiem un koagulācijas tīkla valences samazināšanās ātruma, trombi ātri želējas vai saplūst, kam seko lēna amiloīda agregācija.Apvienojot progresīvu biofizikālo metožu komplektu, mēs varējām raksturot šķidruma un šķidruma αS / Tau fāzes atdalīšanu un identificēt galvenos faktorus, kas izraisa neviendabīgu agregātu veidošanos, kas satur abus proteīnus šķidrā proteīna kondensātā.
Papildus membrānas nodalījumiem telpisko atdalīšanu šūnās var panākt arī, veidojot ar olbaltumvielām bagātus, šķidrumam līdzīgus blīvus ķermeņus, ko sauc par biomolekulāriem kondensātiem vai pilieniem, izmantojot procesu, kas pazīstams kā šķidruma un šķidruma fāzes atdalīšana (LLPS).Šos pilienus veido daudzvērtīga laika mijiedarbība, parasti starp olbaltumvielām vai proteīniem un RNS, un tie pilda dažādas funkcijas gandrīz visās dzīvajās sistēmās.Lielam skaitam LLP spējīgu proteīnu ir zemas sarežģītības sekvences, kas pēc būtības un biomolekulāro kondensātu veidošanās ir ļoti nesakārtotas 3, 4, 5.Daudzi eksperimentāli pētījumi ir atklājuši šo šķidrumiem līdzīgo kondensātu veidojošo proteīnu elastīgo, bieži nesakārtoto un daudzvērtīgo raksturu, lai gan maz ir zināms par specifiskajiem molekulārajiem determinantiem, kas kontrolē šo kondensātu augšanu un nobriešanu līdz cietākam tipam. Valsts..
Jaunie dati apstiprina hipotēzi, ka aberrants proteīnu vadīts LLPS un pilienu pārvēršanās cietās struktūrās var būt nozīmīgi šūnu ceļi, kas noved pie nešķīstošu toksisku agregātu veidošanās, kas bieži ir deģeneratīvu slimību pazīmes.Daudzi ar LLPS saistīti iekšēji nesakārtoti proteīni (IDP), kas bieži ir ļoti uzlādēti un elastīgi, jau sen ir saistīti ar neirodeģenerāciju amiloīda agregācijas procesā.Konkrēti, ir pierādīts, ka biomolekulārie IDP kondensāti, piemēram, FUS7 vai TDP-438, vai proteīni ar lieliem zemas sarežģītības domēniem, piemēram, hnRNPA19, noveco želejveida vai pat cietā formā, izmantojot procesu, ko sauc par fluidizāciju.savienojums.uz cietās fāzes pāreju (LSPT) kā laika funkciju vai reaģējot uz noteiktām pēctranslācijas modifikācijām vai patoloģiski nozīmīgām mutācijām1,7.
Vēl viens IDP, kas saistīts ar LLPS in vivo, ir Tau, ar mikrotubuliem saistīts nesakārtots proteīns, kura amiloīda agregācija ir saistīta ar Alcheimera slimību10, bet nesen ir saistīta arī ar Parkinsona slimību (PD), un ir saistītas citas sinaptiskās kodolproteinopātijas 11, 12, 13.Ir pierādīts, ka Tau spontāni atdalās no šķīduma/citoplazmas labvēlīgas elektrostatiskās mijiedarbības dēļ14, kā rezultātā veidojas ar tau bagātināti pilieni, kas pazīstami kā elektrostatiskie koacervāti.Ir arī novērots, ka šāda veida nespecifiskā mijiedarbība ir daudzu biomolekulāro kondensātu dzinējspēks dabā15.Tau proteīna gadījumā elektrostatisko agregāciju var veidot ar vienkāršu agregāciju, kurā pretēji lādēti proteīna reģioni izraisa šķelšanās procesu, vai ar sarežģītu agregāciju, mijiedarbojoties ar negatīvi lādētiem polimēriem, piemēram, RNS.
Nesen α-sinukleīns (αS), amiloīds IDP, kas saistīts ar PD un citām neirodeģeneratīvām slimībām, kas kopīgi pazīstamas kā sinukleinopātija 17, 18, ir pierādīts šūnu un dzīvnieku modeļos 19, 20, kas koncentrēts olbaltumvielu kondensātos ar šķidrumam līdzīgu uzvedību.In vitro pētījumi ir parādījuši, ka αS tiek pakļauts LLPS vienkāršai agregācijai, izmantojot galvenokārt hidrofobas mijiedarbības, lai gan šim procesam ir nepieciešama ārkārtīgi augsta olbaltumvielu koncentrācija un netipiski ilgs inkubācijas laiks 19, 21.Tas, vai in vivo novērotos αS saturošos kondensātus veido šis vai citi LLPS procesi, joprojām ir galvenā neatrisinātā problēma.Līdzīgi, lai gan αS amiloīda agregācija ir novērota neironos PD un citu sinukleinopātiju gadījumā, precīzs mehānisms, ar kuru αS tiek pakļauts intracelulārai amiloīda agregācijai, joprojām nav skaidrs, jo šķiet, ka šī proteīna pārmērīga ekspresija pati par sevi neizraisa šo procesu.Bieži vien ir nepieciešami papildu šūnu bojājumi, kas liecina, ka intracelulāro αS amiloīda mezglu renukleācijai ir nepieciešamas noteiktas šūnu vietas vai mikrovide.Viena šūnu vide, kas ir īpaši pakļauta agregācijai, var būt olbaltumvielu kondensātu iekšpuse 23 .
Interesanti, ka ir konstatēts, ka αS un tau vienlaikus lokalizējas raksturīgos slimības ieslēgumos cilvēkiem ar Parkinsona slimību un citām sinukleinopātijām 24, 25, un eksperimenti ir ziņojuši par sinerģisku patoloģisku saistību starp diviem proteīniem 26, 27, kas liecina par iespējamu saistību starp agregāciju αS un tau neirodeģeneratīvās slimībās.slimība.Ir konstatēts, ka αS un tau mijiedarbojas un veicina viens otra agregāciju in vitro un in vivo 28, 29 un ir novēroti neviendabīgi agregāti, kas sastāv no šiem diviem proteīniem, smadzenēs pacientiem ar sinukleinopātijām 30 .Tomēr maz ir zināms par αS un tau mijiedarbības molekulāro pamatu un tā koagregācijas mehānismu.Ir ziņots, ka αS mijiedarbojas ar tau, izmantojot elektrostatisko pievilcību starp ļoti negatīvi lādētu αS C-gala reģionu un tau centrālo prolīnu bagāto reģionu, kas arī ir bagātināts ar pozitīvi lādētiem atlikumiem.
Šajā pētījumā mēs parādām, ka αS patiešām var sadalīties pilienos, izmantojot elektrostatisko komplekso kondensāciju tau proteīna klātbūtnē, atšķirībā no tā mijiedarbības ar citiem pozitīvi lādētiem polipeptīdiem, piemēram, poli-L-lizīnu (pLK), un šajā procesā .αS darbojas kā sastatņu molekula pilienu tīklam.Mēs esam identificējuši ievērojamas atšķirības elektrostatisko αS koacervātu nobriešanas procesā, kas ir saistītas ar koacervāta tīklā iesaistīto proteīnu mijiedarbības valences un stipruma atšķirībām.Interesanti, ka mēs novērojām αS un tau amiloīda proteīnu koagregāciju ilgstoši šķidros koacervātos un identificējām dažus galvenos faktorus, kas noved pie šo divu proteīnu koagregācijas šādos koacervātos.Šeit mēs detalizēti aprakstām šo procesu, kas ir iespējams molekulārais mehānisms, kas ir pamatā divu proteīnu kolokalizācijai slimību specifiskos ieslēgumos.
αS ir ļoti anjonu C-gala aste pie neitrāla pH (1.a att.), un mēs izvirzījām hipotēzi, ka tas varētu tikt pakļauts LLPS, kondensējoties elektrostatiskajiem kompleksiem ar polikatjonu nesakārtotām polipeptīdu molekulām.Mēs izmantojām 100 atlieku poli-L-lizīnu (pLK) kā sākuma modeļa molekulu, jo tā ir pozitīvi lādēta un nesakārtota polimēra raksturs pie neitrāla pH 32. Pirmkārt, mēs apstiprinājām, ka pLK mijiedarbojas ar αS Ct domēnu, izmantojot šķīduma KMR spektroskopiju. (1.b attēls), izmantojot 13C/15N iezīmētu αS pieaugošu αS:pLK molāro attiecību klātbūtnē.PLK mijiedarbība ar αS Ct domēnu izpaužas ķīmiskās nobīdes traucējumos un maksimālās intensitātes samazināšanās šajā proteīna reģionā.Interesanti, ka, sajaucot αS ar pLK ar αS koncentrāciju apm.5–25 µM polietilēnglikola (5–15% PEG-8) klātbūtnē (tipisks LLPS buferis: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) mēs nekavējoties izgājām cauri plašam proteīna veidošanās laukam. .pilieni tika novēroti, izmantojot fluorescences (WF) un spilgtā lauka (BF) mikroskopiju (1.c att.).1–5 µm pilieni, kas satur koncentrētu αS (pievienots 1 µM ar AlexaFluor488 iezīmēts αS, AF488-αS), to elektrostatiskās īpašības var iegūt no to izturības pret 10% 1,6-heksāndiolu (1,6-HD) un jutības pret NaCl koncentrācijas palielināšanās (1.c att.).αS/pLK elektrostatiskā kompleksa koacervātu šķidrumam līdzīgo raksturu pierāda to spēja saplūst milisekunžu laikā (1.d attēls).Izmantojot duļķainību, mēs kvantitatīvi noteicām pilienu veidošanos šajos apstākļos, apstiprinājām ar tās stabilitāti saistītās galvenās mijiedarbības elektrostatisko raksturu (1.e att.) un novērtējām dažādu polimēru attiecību ietekmi uz LLPS procesu (1.f att.).Lai gan pilienu veidošanās tiek novērota plašā polimēru attiecību diapazonā, process ir ļoti labvēlīgs, ja pLK pārsniedz αS.Mūžizglītības programmas ir novērotas arī, izmantojot ķīmiski atšķirīgu aizvietotāju dekstrānu-70 (70 kDa) vai izmantojot dažādus paraugu formātus, tostarp stikla priekšmetstikliņu pilienus, dažādu materiālu mikroplates iedobes, Eppendorf vai kvarca kapilārus.
shematisks dažādu olbaltumvielu reģionu attēlojums šajā pētījumā izmantotajos WT-αS un ΔCt-αS variantos.Amfipātiskais N-gala domēns, hidrofobu amiloīdu veidojošais (NAC) reģions un negatīvi lādētais C-gala domēns ir parādīti attiecīgi zilā, oranžā un sarkanā krāsā.Tiek parādīta WT-αS neto maksas par atlikušo (NCPR) karte.b αS/pLK mijiedarbības KMR analīze, ja nav makromolekulu kopu.Palielinoties pLK koncentrācijai (αS:pLK molārās attiecības 1:0,5, 1:1,5 un 1:10 tiek parādītas attiecīgi gaiši zaļā, zaļā un tumši zaļā krāsā).c Koacervējiet αS/pLK (molārā attiecība 1:10) pie 25 µM (1 µM ar AF488 iezīmētu αS vai Atto647N iezīmētu pLK WF attēlveidošanai) LLPS buferšķīdumā (augšā) vai papildinātu ar 500 mM NaCl (apakšā pa kreisi) vai pēc % 1,6-heksāndiols (1,6-HD; apakšā pa labi).Mēroga josla = 20 µm.d Reprezentatīvi mikroskopiski attēli no αS/pLK BF pilienu saplūšanas (molārā attiecība 1:10) koncentrācijā 25 μM;bultiņas norāda atsevišķu pilienu (sarkanās un dzeltenās bultiņas) saplūšanu jaunā pilē (oranža bultiņa) 200 ms laikā) .Mēroga josla = 20 µm.e Gaismas izkliede (pie 350 nm) αS/pLK agregācija LLPS buferšķīdumā pirms un pēc 500 mM NaCl vai 10% 1,6-HD pievienošanas pie 25 µM αS (N = 3 parauga atkārtojumi, norādīta arī vidējā un standarta novirze).f BF attēls (augšpusē) un gaismas izkliedes analīze (pie 350 nm, apakšā) αS/pLK agregācijai pie 25 μM αS, palielinoties αS:pLK molārajai attiecībai (N = 3 parauga atkārtojumi, norādīta arī vidējā un standarta novirze).Mēroga josla = 10 µm.Mēroga josla vienā attēlā norāda visu vienā panelī esošo attēlu mērogu.Neapstrādāti dati tiek nodrošināti neapstrādātu datu failu veidā.
Pamatojoties uz mūsu novērojumiem par αS / pLK elektrostatiskā kompleksa kondensāciju un iepriekšējiem novērojumiem par αS kā tau / RNS kondensāta klienta molekulu tiešā mijiedarbībā ar tau31, mēs izvirzījām hipotēzi, ka αS un tau var segregēt kopā ar šķīdinātāju, ja nav RNS. kondensāts.caur elektrostatiskiem kompleksiem, un αS ir sastatņu proteīns αS/Tau koacervātos (sk. tau lādiņa sadalījumu 2.e attēlā).Mēs novērojām, ka, kad 10 μM αS un 10 μM Tau441 (kas satur attiecīgi 1 μM AF488-αS un 1 μM Atto647N-Tau) tika sajaukti kopā LLPS buferšķīdumā, tie viegli veidoja olbaltumvielu agregātus, kas satur abus proteīnus, kā redzams WF mikroskopijā.(2.a att.).Abu proteīnu kolokalizācija pilienos tika apstiprināta ar konfokālo (CF) mikroskopiju (papildu attēls 1a).Līdzīga uzvedība tika novērota, kad dekstrāns-70 tika izmantots kā agregācijas līdzeklis (papildu 1.c attēls).Izmantojot vai nu ar FITC marķētu PEG, vai dekstrānu, mēs noskaidrojām, ka abi drūzmēšanas līdzekļi bija vienmērīgi sadalīti pa paraugiem, neuzrādot ne segregāciju, ne saistību (papildu 1.d attēls).Drīzāk tas liek domāt, ka šajā sistēmā tie veicina fāzu atdalīšanu, izmantojot makromolekulāras izspiešanas efektus, jo PEG ir īpaši stabils izspiešanas līdzeklis, kā tas redzams citās LLP sistēmās33, 34.Šie ar olbaltumvielām bagātie pilieni bija jutīgi pret NaCl (1 M), bet ne pret 1,6-HD (10% v/v), apstiprinot to elektrostatiskās īpašības (papildu 2.a, b att.).To šķidruma uzvedība tika apstiprināta, novērojot milisekundes saplūšanas pilienus, izmantojot BF mikroskopiju (2.b att.).
αS/Tau441 koacervātu konfokālie (CF) mikroskopiskie attēli LLPS buferšķīdumā (10 μM katra proteīna, 0,5 μM ar AF488 iezīmēta αS un ar Atto647N iezīmēta Tau441).b αS/Tau441 pilienu saplūšanas notikumu reprezentatīvi diferenciālo traucējumu kontrasta (DIC) attēli (10 μM katram proteīnam).c Fāzes diagramma, kuras pamatā ir Tau441 LLPS (0–15 µM) gaismas izkliede (pie 350 nm), ja nav (pa kreisi) vai ir (pa labi) 50 µM αS.Siltākas krāsas norāda uz lielāku izkliedi.d αS/Tau441 LLPS paraugu gaismas izkliede ar pieaugošu αS koncentrāciju (Tau441 pie 5 µM, N = 2–3 parauga atkārtojumi, kā norādīts).e Shematisks attēlojums dažiem tau proteīna variantiem un dažādiem šajā pētījumā izmantotajiem proteīna reģioniem: negatīvi lādēts N-gala domēns (sarkans), ar prolīnu bagāts reģions (zils), mikrotubulus saistošais domēns (MTBD, iezīmēts oranžā krāsā) un amiloīdu veidojošā pāra spirāle.kvēldiega reģioni (PHF), kas atrodas MTBD (pelēks).Tiek parādīta Tau441 neto maksas par atlikumu (NCPR) karte.f Izmantojot 1 µM ar AF488 iezīmētu αS un ar Atto647N iezīmētu ΔNt-, izmantojot 1 µM ar AF488 iezīmētu αS vai ΔCt-αS ΔNt-Tau klātbūtnē (augšpusē, 10 µM uz proteīnu, K15 uz vienu proteīnu, K15 ) ) ) LLPS vai K18 buferšķīdumā kondensētas WF mikrogrāfijas.Mēroga joslas vienā attēlā atspoguļo visu attēlu mērogu vienā panelī (20 µm paneļiem a, b un f).Neapstrādāti dati paneļiem c un d tiek nodrošināti kā neapstrādātu datu faili.
Lai pārbaudītu αS lomu šajā LLPS procesā, mēs vispirms pētījām αS ietekmi uz pilienu stabilitāti ar nefelometriju, izmantojot pieaugošas NaCl koncentrācijas (2.c att.).Jo augstāka ir sāls koncentrācija paraugos, kas satur αS, jo augstākas ir gaismas izkliedes vērtības (pie 350 nm), kas norāda uz αS stabilizējošo lomu šajā LLPS sistēmā.Līdzīgu efektu var novērot, palielinot αS koncentrāciju (un līdz ar to αS:Tau441 attiecību) līdz apm.10 kārtīgs pieaugums attiecībā pret tau koncentrāciju (5 µM) (2.d attēls).Lai pierādītu, ka αS ir sastatņu proteīns koacervātos, mēs nolēmām izpētīt LLPS traucētā Tau mutanta uzvedību, kuram trūkst negatīvi lādēta N-termināla reģiona (atlikumi 1–150, sk. 2.e attēlu), ko sauc par ΔNt-Tau.WF mikroskopija un nefelometrija apstiprināja, ka pats ΔNt-Tau netika pakļauts LLPS (2.f attēls un papildu attēls 2d), kā iepriekš ziņots 14. Tomēr, kad αS tika pievienots šī saīsinātā Tau varianta dispersijas šķīdumiem, LLPS process bija pilnībā pabeigts. atjaunots ar pilienu blīvumu, kas ir tuvu Tau un αS pilna izmēra šķīdumu pilienu blīvumam līdzīgos apstākļos un olbaltumvielu koncentrācijās.Šo procesu var novērot arī zemas makromolekulāras drūzmēšanās apstākļos (papildu 2.c attēls).C-gala αS apgabala, bet ne visā tā garumā, lomu LLPS procesā demonstrēja pilienu veidošanās kavēšana, izmantojot C-gala saīsinātu αS variantu, kuram trūkst 104.–140. atlieku (1.a att.) no (ΔCt-). αS) proteīnu (2.f attēls un papildu attēls 2d).αS un ΔNt-Tau kolokalizācija tika apstiprināta ar konfokālās fluorescences mikroskopiju (papildu 1.b attēls).
Lai turpinātu pārbaudīt LLPS mehānismu starp Tau441 un αS, tika izmantots papildu Tau variants, proti, sapārotais spirālveida pavediena kodola (PHF) fragments mikrotubulu saistošajā domēnā (MTBD), kas, ja tajā ir četri raksturīgi atkārtošanās domēni, kas parasti ir arī zināmi. kā K18 fragments (sk. 2.e att.).Nesen tika ziņots, ka αS galvenokārt saistās ar tau proteīnu, kas atrodas ar prolīnu bagātā domēnā secībā, kas ir pirms mikrotubulus saistošā domēna.Tomēr PHF reģions ir bagāts arī ar pozitīvi lādētiem atlikumiem (sk. 2.e attēlu), īpaši lizīnu (15% atlikumu), kas lika mums pārbaudīt, vai šis reģions arī veicina αS / Tau kompleksa kondensāciju.Mēs novērojām, ka tikai K18 nevarēja izraisīt LLPS koncentrācijā līdz 100 μM pārbaudītajos apstākļos (LLPS buferis ar 15% PEG vai 20% dekstrāna) (2.f attēls).Tomēr, pievienojot 50 µM αS 50 µM K18, ar nefelometriju (papildu 2.d attēls) un WF mikroskopiju (2.f attēls) tika novērota strauja proteīna pilienu veidošanās, kas satur K18 un αS.Kā gaidīts, ΔCt-αS nespēja atjaunot K18 LLPS uzvedību (2. att.).Mēs atzīmējam, ka αS / K18 agregācijai ir nepieciešama nedaudz augstāka olbaltumvielu koncentrācija, lai izraisītu LLPS, salīdzinot ar αS / ΔNt-Tau vai αS / Tau441, ja citas lietas ir vienādas.Tas atbilst spēcīgākai αS C-gala reģiona mijiedarbībai ar prolīnu bagāto Tau domēnu, salīdzinot ar mikrotubulus saistošo domēnu, kā aprakstīts iepriekš 31 .
Ņemot vērā, ka ΔNt-Tau nevar veikt LLPS, ja nav αS, mēs izvēlējāmies šo Tau variantu kā modeli αS / Tau LLPS raksturošanai, ņemot vērā tā vienkāršību LLPS sistēmās ar pilna garuma Tau (izotips, Tau441 / Tau441).ar sarežģītiem (heterotipiskiem, αS/Tau441) agregācijas procesiem.Mēs salīdzinājām αS agregācijas pakāpi (kā daļa no kondensētās fāzes proteīna, fαS,c) αS/Tau un αS/ΔNt-Tau sistēmās ar centrifugēšanas un dispersās fāzes SDS-PAGE analīzi (sk. 2e), konstatējām ļoti līdzīgas vērtības. visiem proteīniem vienā koncentrācijā.Jo īpaši mēs ieguvām fαS,c 84 ± 2% un 79 ± 7% attiecīgi αS / Tau un αS / ΔNt-Tau, kas liecina, ka heterotipiskā mijiedarbība starp αS un tau ir pārāka par mijiedarbību starp tau molekulām.starp.
Mijiedarbība ar dažādiem polikationiem un kondensācijas procesa ietekme uz αS kinētiku vispirms tika pētīta ar fluorescences atjaunošanos pēc fotobalināšanas (FRAP) metodi.Mēs pārbaudījām αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau un αS/pLK koacervātus (100 μM αS papildināts ar 2 μM αS AF488-αS un 100 μM Tau441 vai Δ1 mMLK p vai ).Dati tika iegūti pirmajās 30 minūtēs pēc parauga komponentu sajaukšanas.No reprezentatīviem FRAP attēliem (3.a att., αS/Tau441 kondensācija) un tiem atbilstošajām laika gaitas līknēm (3.b att., 3. papildu attēls) var redzēt, ka αS kinētika ir ļoti līdzīga Tau441 koacervātu kinētikai.un ΔNt-Tau, kas ir daudz ātrāks ar pLK.Aprēķinātie difūzijas koeficienti αS koacervātā saskaņā ar FRAP (kā aprakstījuši Kang et al. 35) ir D = 0,013 ± 0,009 µm2/s un D = 0,026 ± 0,008 µm2/s αS/Tau4-ΔN αS/ sistēma.pLK, Tau un D = attiecīgi 0,18 ± 0,04 µm2/s (3.c att.).Tomēr difūzijas koeficients αS izkliedētajā fāzē ir par vairākām kārtām augstāks par visām kondensētajām fāzēm, kā noteikts ar fluorescences korelācijas spektroskopiju (FCS, skatīt 3. papildu attēlu) tādos pašos apstākļos (LLPS buferis), bet bez polikationu. (D = 8 ± 4 µm2/s).Tāpēc αS translācijas kinētika ir ievērojami samazināta koacervātos, salīdzinot ar proteīniem izkliedētā fāzē, pateicoties izteiktai molekulārai izspiešanas ietekmei, lai gan visi koacervāti saglabā šķidrumam līdzīgas īpašības pirmajā pusstundā pēc to veidošanās, atšķirībā no tau fāzes.ātrāka kinētika pLK kondensātā.
a–c FRAP analīze αS dinamikai (2% ar AF488 iezīmēta αS) elektrostatiskajos koacervātos.αS / Tau441 FRAP testu reprezentatīvie attēli trīs eksemplāros ir parādīti (a), kur sarkani apļi norāda uz atkrāsotajiem apgabaliem.Mēroga josla ir 5 µm.b Vidējās FRAP līknes un (c) aprēķinātie difūzijas koeficienti (D) 5–6 (N) dažādiem pilieniem no trim eksperimentiem, izmantojot 100 µM αS un Tau441 (sarkans) vai ΔNt-Tau (zils) vai pLK (zaļš) ekvimolāras koncentrācijas. ar desmitkārtīgu LLPS koncentrāciju.FRAP līknes standarta novirze ir parādīta iekrāsotā krāsā.Salīdzinājumam difūzijas koeficients αS izkliedētajā fāzē tika noteikts trīs eksemplāros, izmantojot fluorescences korelācijas spektroskopiju (FCS) (plašāku informāciju skatiet 3. papildu attēlā un metodes).d Nepārtraukti X joslas EPR spektri 100 μM TEMPOL-122-αS LLPS buferšķīdumā bez polikationa (melns) vai 100 μM Tau441 (sarkans) vai ΔNt-Tau (zils) vai 1 mM pLK (zaļš) klātbūtnē.Ielaidums parāda palielinātu skatu uz spēcīgajām lauka līnijām, kur notiek visdramatiskākās izmaiņas.e 50 μM TEMPOL-122-αS saistīšanās līknes ar dažādiem polikationiem, ja nav LLPS (bez PEG).Ir pierādīts, ka III joslas samazinātā amplitūda, salīdzinot ar II joslu (IIII/III) normalizētā EPR spektrā, palielina Tau441 (sarkans), ΔNt-Tau (zils) un pLK (zaļš) molārās attiecības.Krāsainās līnijas parāda atbilstību datiem, izmantojot aptuvenu saistīšanas modeli ar n identiskām un neatkarīgām saistīšanas vietām katrā līknē.Neapstrādāti dati tiek nodrošināti neapstrādātu datu failu veidā.
Kā papildinājumu mēs pētījām αS dinamiku dažādos koacervātos, izmantojot virzītu spin marķēšanu (SDSL) un nepārtrauktu elektronu paramagnētisko rezonansi (CW-EPR).Šī metode ir izrādījusies ļoti noderīga, ziņojot par IDP elastību un dinamiku ar reālistisku atlikušo izšķirtspēju36, 37, 38.Šim nolūkam mēs izveidojām cisteīna atlikumus atsevišķos Cys mutantos un izmantojām 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidīna-N-oksila (TEMPOL) spin zondi.Maleimīda atvasinājumi tos marķē.Precīzāk, mēs ievietojām TEMPOL zondes pozīcijā 122 vai 24 αS (TEMPOL-122-αS un TEMPOL-24-αS).Pirmajā gadījumā mēs mērķējam uz proteīna C-gala reģionu, kas ir iesaistīts mijiedarbībā ar polikationiem.Tā vietā 24. pozīcija var sniegt mums informāciju par proteīnu kopējo dinamiku kondensātā.Abos gadījumos EPR signāli, kas iegūti izkliedētās fāzes proteīniem, atbilda nitroksīda radikāļiem ātri kustīgā stāvoklī.Pēc fāzes atdalīšanas tau vai pLK klātbūtnē (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 vai ΔNt-Tau attiecībā 1:1 vai pLK attiecībā 1:10) tika novērota relatīvās pīķa intensitātes palielināšanās αS EPR spektrs.Zaudējumu līnija paplašinājās, norādot uz samazinātu αS pārorientācijas kinētiku pilienos, salīdzinot ar olbaltumvielām atšķaidītā fāzē (3.d attēls, papildu 4.a attēls).Šīs izmaiņas ir izteiktākas 122. pozīcijā. Kamēr 24. pozīcijā pLK klātbūtne neietekmēja zondes kinētiku, 122. pozīcijā spektrālās līnijas forma būtiski mainījās (papildu 4.a attēls).Mēģinot modelēt spektrus divu αS / polikāciju sistēmu 122. pozīcijā, izmantojot izotropo modeli (papildu attēls 5a), ko parasti izmanto, lai aprakstītu ar spin iezīmētā IDP38, 39 dinamiku, mēs nevarējām rekonstruēt eksperimentālos spektrus..24 griezienu kontrastu pozīcijas spektrālā simulācija (papildu 5.a attēls).Tas liek domāt, ka polikationu klātbūtnē αS C-gala reģiona spin konfigurāciju telpā ir preferenciālas pozīcijas.Apsverot αS frakciju kondensētajā fāzē eksperimentālos EPR apstākļos (84 ± 2%, 79 ± 7% un 47 ± 4% attiecīgi αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau un αS / pLK), skatiet Papildu. Datu analīzes c) 2.e att., redzams, ka ar EPR metodi konstatētais paplašināšanās galvenokārt atspoguļo αS C-gala reģiona mijiedarbību ar dažādiem polikationiem kondensētajā fāzē (galvenās izmaiņas, lietojot TEMPOL-122- αS), nevis olbaltumvielu kondensācija.Zondē tiek novērota mikroviskozitātes palielināšanās.Kā gaidīts, proteīna EPR spektrs citos apstākļos, nevis LLPS, tika pilnībā atjaunots, kad maisījumam tika pievienots 1 M NaCl (papildu 4.b attēls).Kopumā mūsu dati liecina, ka CW-EPR atklātās izmaiņas galvenokārt atspoguļo αS C-gala reģiona mijiedarbību ar dažādiem polikationiem kondensētajā fāzē, un šī mijiedarbība, šķiet, ir spēcīgāka ar pLK nekā ar Tau.
Lai iegūtu vairāk strukturālās informācijas par proteīniem koacervātā, mēs nolēmām izpētīt LLPS sistēmu, izmantojot KMR šķīdumā.Tomēr mēs varējām noteikt tikai αS frakciju, kas palikusi izkliedētajā fāzē, kas var būt saistīta ar samazinātu olbaltumvielu dinamiku koacervātā un blīvu fāzi šķīduma apakšā KMR analīzē.Kad mēs analizējām LLPS parauga izkliedētajā fāzē atlikušā proteīna struktūru un dinamiku, izmantojot KMR (papildu 5.c, d attēls), mēs pamanījām, ka proteīns uzvedās gandrīz identiski pLK un ΔNt-Tau klātbūtnē. kas atradās proteīna mugurkaula sekundārajā struktūrā un dinamikā, ko atklāja eksperimenti ar sekundāro ķīmisko nobīdi un R1ρ relaksāciju.KMR dati liecina, ka αS C-galam ir ievērojams konformācijas elastības zudums, vienlaikus saglabājot savu nesakārtoto raksturu, tāpat kā pārējā proteīna secībā, pateicoties tās mijiedarbībai ar polikationiem.
Tā kā CW-EPR signāla paplašināšanās, kas novērota TEMPOL-122-αS kondensētajā fāzē, atspoguļo proteīna mijiedarbību ar polikationiem, mēs veicām EPR titrēšanu, lai novērtētu αS saistīšanās afinitāti ar dažādiem polikationiem, ja nav LLPS (nav uzkrāšanās Buferis LLPS), kas liecina, ka mijiedarbība ir vienāda atšķaidītā un koncentrētā fāzē (ko apstiprina mūsu dati, 4.a papildu attēls un 6. papildu attēls).Mērķis bija noskaidrot, vai visiem koacervātiem, neskatoties uz to kopīgajām šķidrumam līdzīgajām īpašībām, ir kāda pamatā esošā atšķirīga uzvedība molekulārā līmenī.Kā gaidīts, EPR spektrs paplašinājās, palielinoties polikāciju koncentrācijai, atspoguļojot molekulārās elastības samazināšanos visu mijiedarbības partneru molekulārās mijiedarbības dēļ gandrīz līdz piesātinājumam (3.e att., 6. papildu attēls).pLK sasniedza šo piesātinājumu ar zemāku molāro attiecību (polikation: αS), salīdzinot ar ΔNt-Tau un Tau441.Faktiski datu salīdzinājums ar aptuvenu saistīšanās modeli, pieņemot, ka n identiskas un neatkarīgas saistīšanās vietas, parādīja, ka pLK šķietamā disociācijas konstante (~ 5 μM) ir par kārtu zemāka nekā Tau441 vai ΔNt-Tau (~ 50 μM) ).µM).Lai gan tas ir aptuvens aprēķins, tas liecina, ka αS ir lielāka afinitāte pret vienkāršākiem polikationiem ar nepārtrauktiem pozitīva lādiņa reģioniem.Ņemot vērā šo atšķirību afinitātē starp αS un dažādiem polikationiem, mēs izvirzījām hipotēzi, ka to šķidruma īpašības laika gaitā var mainīties un tādējādi ciest no dažādiem LSPT procesiem.
Ņemot vērā ļoti pārpildīto vidi proteīna koacervātā un proteīna amiloīdo raksturu, mēs novērojām koacervāta uzvedību laika gaitā, lai noteiktu iespējamos LSPT procesus.Izmantojot BF un CF mikroskopiju (4. attēls), mēs novērojām, ka αS / Tau441 lielā mērā koacervējas šķīdumā, veidojot lielus pilienus, kas saskaras un mitrina virsmu iedobes/slaida apakšā kā pilni pilieni, kā paredzēts (papildu attēls 7.d);mēs šīs apakšā veidotās struktūras saucam par "olbaltumvielu plostiem".Šīs struktūras palika šķidras, jo saglabāja spēju saplūst (7.b papildu att.) un bija redzamas vairākas stundas pēc LLPS iedarbināšanas (4. attēls un papildu 7.c attēls).Mēs novērojām, ka mitrināšanas process ir labvēlīgs hidrofilu, nevis hidrofobu materiālu virsmām (papildu attēls 7a), kā paredzēts elektrostatiskajiem koacervātiem ar nelīdzsvarotiem lādiņiem un tādējādi augstu elektrostatisko virsmas potenciālu.Konkrēti, αS/ΔNt-Tau saplūšana un pludināšana tika ievērojami samazināta, savukārt αS/pLK kondensāti tika ievērojami samazināti (4. att.).Īsajā inkubācijas laikā αS / pLK pilieni spēja saplūst un samitrināt hidrofilo virsmu, taču šis process ātri apstājās un pēc 5 stundu inkubācijas tika novēroti tikai ierobežoti saplūšanas notikumi un mitrināšana.– gēla-pilienu pāreja.
Reprezentatīvi BF (pelēktoņu paneļi) un CF (labie paneļi, ar AF488 iezīmēts αS zaļā krāsā) koacervāta paraugiem, kas satur 100 µM αS (1% fluorescējoša etiķete) LLPS buferšķīdumā 100 µM Tau441 (augšējā) mikrofluorescences attēlu klātbūtnē. -Tau (centrā) vai 1 mM pLK (apakšā) dažādos inkubācijas laikos un fokusa augstumos (z, attālums no plāksnes iedobes apakšas).Eksperimenti tika atkārtoti 4-6 reizes neatkarīgi viens no otra ar tādiem pašiem rezultātiem.αS/Tau441 koacervāti tiek samitrināti pēc 24 stundām, veidojot plostus, kas ir lielāki par attēlu.Mēroga josla visiem attēliem ir 20 µm.
Pēc tam mēs jautājām, vai lielie šķidrumam līdzīgie proteīnu kopumi, kas veidojas αS / Tau441 LLPS, izraisīs kāda no pētītajām olbaltumvielām amiloīda agregāciju.Mēs sekojām αS/Tau441 pilienu nobriešanai laika gaitā ar WF mikroskopiju tādos pašos apstākļos kā iepriekš, bet izmantojot 1 μM ar AF488 iezīmētu αS un ar Atto647N iezīmētu Tau441 (5.a att.).Kā gaidīts, mēs novērojām pilnīgu olbaltumvielu lokalizāciju visā nogatavināšanas procesā.Interesanti, ka no apm.Pēc 5 stundām plostu iekšpusē tika novērotas intensīvākas neapļveida struktūras, kuras mēs saucām par "punktiem", no kuriem daži bija kolokalizēti ar αS, bet daži bija bagātināti ar Tau441 (5.a att., baltas bultiņas).Šie plankumi plostos vienmēr ir novēroti lielākā mērā attiecībā uz αS/ΔNt-Tau nekā attiecībā uz αS/ΔNt-Tau.PLK un Tau sistēmu pilienos nebija atšķirīgu plankumu, kas nebija kompetentas saplūšanai / mitrināšanai.Lai pārbaudītu, vai šie traipi, kas satur αS un Tau441, ir amiloīdiem līdzīgi agregāti, mēs veicām līdzīgu eksperimentu, izmantojot CF mikroskopiju, kurā Tau441 tika marķēts ar Atto647N un no paša sākuma tika pievienots 12,5 μM amiloīdam specifisks tioflavīns-T (ThT).krāsviela.Lai gan αS/Tau441 pilienu vai plostu ThT iekrāsošanās netika novērota pat pēc 24 h inkubācijas (5.b att., augšējā rinda — atlikušie pilieni pār proteīna plostiem), ThT pozitīvās struktūras, kas satur Atto647N-Tau441 plostu iekšpusē, bija ļoti vājas.tas atkārto iepriekš aprakstīto plankumu izmēru, formu un atrašanās vietu (5.b att., vidējā un apakšējā rinda), kas liecina, ka plankumi var atbilst amiloīdiem līdzīgiem agregātiem, kas veidojas novecojošos šķidruma koacervātos.
WF 25 μM αS dažādos inkubācijas laikos un fokusa augstumos (z, attālums no nesaistītā dibena) 25 μM Tau441 (1 μM ar AF488 iezīmēta αS un Atto647N iezīmēta Tau441) klātbūtnē mikroskopa bufera plāksnes iedobē ar LLPS. .Seši eksperimenti tika neatkarīgi atkārtoti ar līdzīgiem rezultātiem.b CF mikroskopisks attēls ar 25 μM αS 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N iezīmēta Tau441) un 12,5 μM tioflavīna-T (ThT) klātbūtnē.Svērtie olbaltumvielu pilieni un nogulsnētie proteīnu plosti un plankumi ir parādīti attiecīgi augšējā un vidējā rindā.Apakšējā rindā ir redzami plostu un kritienu attēli no 3 neatkarīgiem atkārtojumiem.Baltas bultiņas norāda uz ThT pozitīvus punktus abos paneļos.Mēroga josla visiem attēliem ir 20 µm.
Lai sīkāk izpētītu izmaiņas koacervāta olbaltumvielu tīklā, pārejot no šķidruma uz cietu, mēs izmantojām fluorescences mūža attēlveidošanu (FLIM) un Förster rezonanses enerģijas pārneses mikroskopiju (FRET) (6. attēls un papildu 8. un 9. attēls).Mēs izvirzījām hipotēzi, ka slāņa koacervācijas nobriešana kondensētāk vai pat cietai līdzīgā agregētā proteīna struktūrā noved pie ciešāka kontakta starp proteīnu un tai pievienoto fluorescējošo zondi, potenciāli radot dzesējošu efektu, kas izpaužas saīsinātā zondes kalpošanas laikā (τ) , kā aprakstīts iepriekš40.,41,42.Turklāt dubulti marķētiem paraugiem (attiecīgi AF488 un Atto647N kā FRET donoru un akceptoru krāsvielas) šo τ samazināšanos var pavadīt arī koacervāta kondensācija un FRET (E) efektivitātes palielināšanās LSPT laikā.Mēs novērojām plostu un plankumu veidošanos laika gaitā LLPS αS/Tau441 un αS/ΔNt-Tau paraugos (25 µM katra proteīna LLPS buferšķīdumā, kas satur 1 µM AF488 marķētu αS un/vai Atto647N, kas marķēts ar Tau441 vai ΔNt-Tau).Mēs novērojām vispārēju tendenci, ka AF488 (τ488) un Atto647N (τ647N) zondu fluorescences kalpošanas laiks nedaudz samazinājās, kad koacervāti nogatavojās (6. attēls un papildu 8.c attēls).Interesanti, ka šīs izmaiņas tika ievērojami uzlabotas punktiem plostos (6.c att.), norādot, ka punktos notika turpmāka olbaltumvielu kondensācija.Lai to pamatotu, αS / ΔNt-Tau pilieniem, kas novecojuši 24 stundas (papildu 8.d attēls), netika novērotas būtiskas izmaiņas fluorescences mūžā, kas liecina, ka pilienu želēšana ir process, kas atšķiras no plankumainības un kam nav pievienota būtiska molekulārā reorganizācija. koacervātu ietvaros.Jāatzīmē, ka punktiem αS ir dažādi izmēri un mainīgs saturs, īpaši αS / Tau441 sistēmai (papildu 8.e attēls).Punktu fluorescences ilguma samazināšanos papildināja intensitātes palielināšanās, īpaši Atto647N, kas marķēta ar Tau441 (papildu 8.a attēls), un augstāka FRET efektivitāte gan αS/Tau441, gan αS/ΔNt-Tau sistēmām, kas liecina par turpmāku kondensāciju LLPS piecās stundās. pēc iedarbināšanas statiskās elektrības iekšpusē esošās olbaltumvielas kondensējās.Salīdzinot ar αS / ΔNt-Tau, mēs novērojām zemākas τ647N un nedaudz augstākas τ488 vērtības αS / Tau441 vietās, ko papildināja zemākas un neviendabīgākas FRET vērtības.Iespējams, tas var būt saistīts ar faktu, ka αS / Tau441 sistēmā novērotais un sagaidāmais αS pārpilnība agregātos ir neviendabīgāka, bieži vien substehiometriskāka salīdzinājumā ar Tau, jo arī Tau441 var tikt pakļauts LLPS un agregācijai (papildu attēls 8e). .Tomēr pilienu saplūšanas pakāpe, plostu veidošanās un, galvenais, olbaltumvielu agregācija šķidrumam līdzīgos koacervātos ir maksimāla, ja ir gan Tau441, gan αS.
αS/Tau441 un αS/ΔNt-Tau mūža fluorescences mikroskopijas (FLIM) attēli pie 25 μM katra proteīna (1 μM ar AF488 iezīmēts αS un 1 μM Atto647N iezīmēts Tau441 vai ΔNt buferis).Kolonnās ir parādīti reprezentatīvi LLPS paraugu attēli dažādos nogatavināšanas laikos (30 min, 5 h un 24 h).Sarkanais rāmis parāda reģionu, kurā ir αS / Tau441 plankumi.Dzīves ilgums tiek parādīts kā krāsu joslas.Mēroga josla = 20 µm visiem attēliem.b Pietuvināts atlasītā apgabala FLIM attēls, kas parādīts paneļa a sarkanajā lodziņā.Dzīves diapazoni tiek parādīti, izmantojot to pašu krāsu skalu kā panelī a.Mēroga josla = 5 µm.c Histogrammas, kas parāda AF488 (pievienots αS) vai Atto647N (pievienots Tau) dažādām proteīnu sugām (pilieni-D-, plosts-R- un plankumi-P), kas identificētas FLIM attēlos, kas ierakstīti αS-), laika sadalījuma Tau441 un Tau441 kalpošanas laiks. αS/ΔNt-Tau koacervāta paraugi (N = 17-32 ROI D, 29-44 ROI R un 21-51 ROI punktiem).Vidējās un vidējās vērtības tiek parādītas attiecīgi kā dzelteni kvadrāti un melnas līnijas lodziņos.Lodziņa apakšējā un augšējā robeža apzīmē attiecīgi pirmo un trešo kvartili, un minimālās un maksimālās vērtības 1,5 reizes starpkvartiļu diapazonā (IQR) ir parādītas kā ūsas.Ārpuses ir parādītas kā melni dimanti.Statistiskā nozīmība starp sadalījumu pāriem tika noteikta, izmantojot divu paraugu t-testu, pieņemot nevienādas dispersijas.Divpusējās t-testa p vērtības ir parādītas ar zvaigznītēm katram salīdzināto datu pārim (* p-vērtība > 0,01, ** p-vērtība > 0,001, *** p-vērtība > 0,0001, **** p-vērtība > 0,00001), ns Norāda uz nenozīmīgumu (p-vērtība > 0,05).Precīzas p vērtības ir norādītas 1. papildu tabulā, un sākotnējie dati tiek parādīti kā neapstrādātu datu faili.
Lai vēl vairāk demonstrētu plankumu/agregātu amiloīda veida raksturu, nekrāsotus koacervāta paraugus 24 stundas apstrādājām ar augstu (1 M) NaCl koncentrāciju, kā rezultātā agregāti tika atdalīti no olbaltumvielu koacervātiem.Novērojot izolētus agregātus (ti, izkliedētu agregātu šķīdumu), izmantojot atomu spēka mikroskopiju (AFM), mēs novērojām pārsvarā sfērisku morfoloģiju ar regulāru aptuveni 15 nm augstumu, kurai ir tendence asociēties augstas sāls koncentrācijas apstākļos, līdzīgi kā tipisku amiloīda šķiedru uzvedība, ko izraisa spēcīga hidrofoba iedarbība uz virsmu (ņemiet vērā, ka fibrilu augstums parasti ir ~ 10 nm) (papildu 10.a attēls).Interesanti, ka, standarta ThT fluorescences testā inkubējot izolētus agregātus ar ThT, mēs novērojām dramatisku ThT fluorescences kvantu iznākuma pieaugumu, kas ir salīdzināms ar to, kas tika novērots, kad krāsviela tika inkubēta ar tipiskām αS amiloīda fibrilām (papildu attēls 10b), kas liecina, ka koacervāta agregāti satur amiloīdam līdzīgas struktūras..Faktiski agregāti bija izturīgi pret augstu sāls koncentrāciju, bet jutīgi pret 4 M guanidīna hlorīdu (GdnHCl), tāpat kā tipiskas amiloīda fibrillas (papildu 10.c attēls).
Pēc tam mēs analizējām agregātu sastāvu, izmantojot vienas molekulas fluorescenci, specifisku fluorescences korelācijas / krusteniskās korelācijas spektroskopiju (FCS / FCCS) un divu krāsu sakritības noteikšanas (TCCD) pārrāvuma analīzi.Šim nolūkam mēs izolējām agregātus, kas izveidojās pēc 24 stundu inkubācijas 100 μl LLPS paraugos, kas satur αS un Tau441 (abi 25 μM) kopā ar 1 μM AF488 iezīmētu αS un 1 μM Atto647N marķētu Tau441N.Iegūto izkliedēto agregātu šķīdumu atšķaida līdz monomolekulāram stāvoklim, izmantojot to pašu PEG nesaturošu buferšķīdumu un 1 M NaCl (to pašu buferšķīdumu, ko izmanto, lai atdalītu agregātus no koacervāta), lai novērstu jebkādu iespējamo elektrostatisko mijiedarbību starp LLPS un proteīnu.Vienas molekulas laika trajektorijas piemērs ir redzams 7.a attēlā.FCCS/FCS analīze (savstarpējā korelācija, CC un autokorelācija, AC) parādīja, ka paraugos bija daudz agregātu, kas satur αS un tau (sk. CC līkni 7.b attēlā, kreisajā panelī), un monomēra atlikuma proteīna pārpalikums radās kā atšķaidīšanas procesa rezultāts (sk. maiņstrāvas līknes 7.b attēlā, kreisajā panelī).Kontroleksperimenti, kas tika veikti tādos pašos šķīduma apstākļos, izmantojot paraugus, kas satur tikai monomērus proteīnus, neuzrādīja CC līknes, un AC līknes labi sader ar vienkomponenta difūzijas modeli (4. vienādojums), kur monomēru proteīniem ir paredzamie difūzijas koeficienti (7.b att. ), labais panelis).Agregēto daļiņu difūzijas koeficients ir mazāks par 1 µm2/s, bet monomēru proteīnu difūzijas koeficients ir aptuveni 1 µm2/s.50–100 µm/s;vērtības ir līdzīgas iepriekš publicētajām vērtībām ar ultraskaņu apstrādātām αS amiloīda fibrilām un monomēra αS atsevišķi līdzīgos šķīduma apstākļos44.Kad mēs analizējām agregātus ar TCCD eksplozijas analīzi (7.c attēls, augšējais panelis), mēs atklājām, ka katrā izolētajā agregātā (αS/Tau heteroagregāts) aptuveni 60% no atklātajiem agregātiem saturēja gan αS, gan tau, aptuveni 30% saturēja tikai tau, tikai aptuveni 10% αS.αS/Tau heteroagregātu stehiometriskā analīze parādīja, ka lielākā daļa heteroagregātu bija bagātināti ar tau (stehiometrija zem 0,5, vidējais tau molekulu skaits vienā agregātā ir 4 reizes lielāks nekā αS molekulām), kas atbilst mūsu darbam, kas novērots FLIM in situ. eksperimentiem..FRET analīze parādīja, ka šie agregāti saturēja abus proteīnus, lai gan faktiskajām FRET vērtībām šajā gadījumā nav lielas nozīmes, jo fluoroforu sadalījums katrā agregātā bija nejaušs, jo eksperimentā tika izmantots pārmērīgs nemarķēts proteīns.Interesanti, ka, veicot to pašu analīzi, izmantojot 45,46 nobriedušu amiloīda agregācijas deficīta Tau variantu (sk. Papildu 11.a, b att.), mēs pamanījām, ka, lai gan αS elektrostatiskā agregācija bija tāda pati (papildu 11.c, d attēls). spēja veidot agregātus koacervātā tika krasi samazināta, un FLIM atklāja vairākus plankumus in situ eksperimentos, un izolētiem kopparaugiem tika novērotas vājas savstarpējās korelācijas līknes.Tomēr nelielam skaitam atklāto agregātu (tikai desmitā daļa no Tau441) mēs novērojām, ka katrs agregāts bija bagātināts ar αS nekā šis Tau variants, un aptuveni 50% no atklātajiem agregātiem satur tikai αS molekulas, un αS bija neviendabīgs pārpalikumā. .agregāti (sk. Papildu 11.e att.), atšķirībā no Tau441 radītajiem neviendabīgajiem agregātiem (6.f att.).Šo eksperimentu rezultāti parādīja, ka, lai gan pats αS spēj uzkrāties ar tau koacervātā, tau kodols šajos apstākļos ir labvēlīgāks, un iegūtie amiloīdiem līdzīgie agregāti spēj darboties kā αS un tau forma.Tomēr, tiklīdz ir izveidots ar tau bagāts kodols, heterotipiskā mijiedarbība starp αS un tau tiek dota priekšroka agregātos, nevis homotipiskā mijiedarbība starp tau molekulām;mēs novērojam arī olbaltumvielu tīklus šķidros αS / tau koacervātos.
aS/Tau441 elektrostatiskajos koacervātos izveidoto izolētu agregātu atsevišķu molekulu reprezentatīvas fluorescences laika pēdas.Pārrāvumi, kas atbilst αS / Tau441 koagregātiem (pārrāvumi virs norādītā sliekšņa), tika novēroti trīs noteikšanas kanālos (AF488 un Atto647N emisija pēc tiešas ierosmes, zilās un sarkanās līnijas, Atto647N emisija pēc netiešas ierosmes), FRET, violeta līnija).b FCS/FCCS analīze izolētu αS/Tau441 agregātu paraugam, kas iegūts no LLPS (kreisais panelis).Autokorelācijas (AC) līknes AF488 un Atto647N ir parādītas attiecīgi zilā un sarkanā krāsā, un krusteniskās korelācijas (CC) līknes, kas saistītas ar agregātiem, kas satur abas krāsvielas, ir parādītas purpursarkanā krāsā.AC līknes atspoguļo marķētu monomēru un agregētu proteīnu sugu klātbūtni, savukārt CC līknes parāda tikai divkārši marķētu agregātu difūziju.Tāda pati analīze, bet tādos pašos šķīduma apstākļos kā izolētos punktos, labajā panelī kā kontroles tiek parādīti paraugi, kas satur tikai monomēru αS un Tau441.c αS/Tau441 elektrostatiskajos koacervātos izveidoto izolētu agregātu atsevišķu molekulu fluorescences zibens analīze.Informācija par katru agregātu, kas atrodams četros dažādos atkārtojumos (N = 152), ir attēlota attiecībā pret to stehiometriju, S vērtībām un FRET efektivitāti (augšējais panelis, krāsu josla atspoguļo notikumu).Var izšķirt trīs veidu agregātus: -αS-tikai agregāti ar S~1 un FRET~0, Tau-tikai agregāti ar S~0 un FRET~1 un neviendabīgi Tau/αS agregāti ar starpposmu S un FRET Daudzuma aplēses. Abu marķieru proteīni, kas konstatēti katrā neviendabīgā agregātā (N = 100), ir parādīti apakšējā panelī (krāsu skala atspoguļo notikumu).Neapstrādāti dati tiek nodrošināti neapstrādātu datu failu veidā.
Ir ziņots, ka šķidro proteīnu kondensātu nobriešana vai novecošana, veidojot želejveida vai cietas struktūras laika gaitā, ir saistīta ar vairākām kondensāta fizioloģiskajām funkcijām47, kā arī slimībās kā patoloģisks process pirms amiloīda agregācijas 7, 48, 49. mēs detalizēti pētām fāžu atdalīšanu un uzvedību.LSPT αS nejaušu polikationu klātbūtnē kontrolētā vidē zemās mikromolārās koncentrācijās un fizioloģiski nozīmīgos apstākļos (ņemiet vērā, ka aprēķinātā αS fizioloģiskā koncentrācija ir> 1 µM50), pēc tipiskas LPS termodinamiski vadītas uzvedības.Mēs noskaidrojām, ka αS, kas satur ļoti negatīvi lādētu C-gala reģionu pie fizioloģiskā pH, spēj veidot ar olbaltumvielām bagātus pilienus ūdens šķīdumā caur LLPS ļoti katjonu nesakārtotu peptīdu, piemēram, pLK vai Tau, klātbūtnē, izmantojot elektrostatisko procesu. kompleksa kondensācija agregācijas makromolekulu klātbūtnē.Šim procesam var būt nozīmīga ietekme šūnu vidē, kur αS saskaras ar dažādām polikatjonu molekulām, kas saistītas ar tā slimību saistītu agregāciju gan in vitro, gan in vivo 51, 52, 53, 54.
Daudzos pētījumos olbaltumvielu dinamika pilienos tika uzskatīta par vienu no galvenajiem faktoriem, kas nosaka nobriešanas procesu55, 56.Elektrostatiskajos αS koacervātos ar polikationiem nobriešanas process acīmredzot ir atkarīgs no mijiedarbības stipruma ar polikationiem, valences un šo mijiedarbību daudzveidības.Līdzsvara teorija liecina, ka divu šķidru stāvokļu līdzsvara ainava būtu liela ar biopolimēriem bagāta piliena klātbūtne, kas virza LLPS57, 58.Pilienu augšanu var panākt ar Ostvalda nobriešanu59, saplūšanu60 vai brīvā monomēra patēriņu izkliedētā fāzē61.Attiecībā uz αS un Tau441, ΔNt-Tau vai pLK lielākā daļa olbaltumvielu tika koncentrēta kondensātā šajā pētījumā izmantotajos apstākļos.Tomēr, lai gan pilna izmēra tau pilieni ātri saplūda pēc virsmas mitrināšanas, pilienu saplūšana un mitrināšana bija sarežģīta ΔNt-Tau un pLK, kas liecina par strauju šķidruma īpašību zudumu šajās divās sistēmās.Saskaņā ar mūsu FLIM-FRET analīzi novecojušie pLK un ΔNt-Tau pilieni uzrādīja līdzīgu olbaltumvielu agregācijas pakāpi (līdzīgs fluorescences kalpošanas laiks) kā sākotnējiem pilieniem, kas liecina, ka sākotnējais olbaltumvielu tīkls tika saglabāts, kaut arī stingrāks.
Mēs racionalizējam savus eksperimentālos rezultātus šādā modelī (8. attēls).Sākotnēji uz laiku izveidotie pilieni bieži ir proteīnu tīkli bez elektrostatiskās kompensācijas, un tādējādi rodas lādiņu nelīdzsvarotības zonas, īpaši pilienu saskarnē, kā rezultātā rodas pilieni ar augstu elektrostatiskās virsmas potenciālu.Lai kompensētu lādiņu (parādību, ko parasti dēvē par valences samazināšanos) un samazinātu pilienu virsmas potenciālu, pilieni var ietvert jaunus polipeptīdus no atšķaidītās fāzes, reorganizēt proteīnu tīklus, lai optimizētu lādiņa-lādiņa mijiedarbību, un mijiedarboties ar citiem pilieniem.ar virsmām (mitrināšana).Šķiet, ka αS/pLK pilieni vienkāršāka olbaltumvielu tīkla (tikai heterotipiskas mijiedarbības starp αS un pLK) un lielākas afinitātes pret proteīna-olbaltumvielu mijiedarbībām spēj ātrāk līdzsvarot kondensāta lādiņu;patiešām, mēs novērojām ātrāku olbaltumvielu kinētiku sākotnēji izveidotajos αS / pLK koacervātos nekā αS / Tau.Pēc valences samazināšanās mijiedarbība kļūst mazāk īslaicīga, un pilieni zaudē savas šķidrās īpašības un pārvēršas par želejveida, neuzliesmojošiem pilieniem ar zemu elektrostatisko virsmas potenciālu (un tāpēc tie nespēj samitrināt virsmu).Turpretim αS / Tau pilieni ir mazāk efektīvi, lai optimizētu pilienu lādiņa līdzsvaru, jo ir sarežģītāki olbaltumvielu tīkli (gan ar homotipisku, gan heterotipisku mijiedarbību) un olbaltumvielu mijiedarbības vājākā rakstura.Tā rezultātā rodas pilieni, kas ilgstoši saglabā šķidruma uzvedību un kuriem ir augsts elektrostatiskais virsmas potenciāls, kas tiek samazināts, apvienojoties un augot (tādējādi samazinot pilienu virsmas laukuma/tilpuma attiecību) un mitrinot hidrofilās virsmas ķīmisko vielu.Tas rada lielas koncentrētas olbaltumvielu bibliotēkas, kas saglabā šķidruma īpašības, jo mijiedarbība joprojām ir ļoti pārejoša, jo proteīnu tīklā pastāvīgi tiek meklēta lādiņa optimizācija.Interesanti, ka N-galā saīsinātām Tau formām, tostarp dažām dabā sastopamām izoformām62, ir vidēja uzvedība, un dažas novecošanās ar αS veido ilgstošus želejveida pilienus, bet citas pārvēršas lielos šķidros kondensātos.Šī αS elektrostatisko koacervātu nogatavināšanas dualitāte atbilst jaunākajiem LLPS teorētiskajiem un eksperimentālajiem pētījumiem, kas ir identificējuši korelāciju starp valences samazināšanos un elektrostatisko sijāšanu kondensātos kā atslēgu kondensāta izmēra un šķidruma īpašību kontrolei.Mehānisms 58.61.
Šī shēma parāda iespējamo amiloīda agregācijas ceļu αS un Tau441, izmantojot LLPS un LSPT.Ar papildu anjoniem bagātiem (sarkaniem) un katjoniem bagātiem (ziliem) reģioniem αS un tau elektrostatiskajiem koacervātiem ar apmierinošu valenci ir zemāka virsmas enerģija un līdz ar to mazāka saplūšana, kā rezultātā notiek strauja pilienu novecošanās.Tiek sasniegts stabils neaglomerēts gēla stāvoklis..Šī situācija ir ļoti labvēlīga αS / pLK sistēmas gadījumā, pateicoties tās lielākai afinitātei un vienkāršākam proteīnu pāru mijiedarbības tīklam, kas nodrošina ātru želejveida pāreju.Gluži pretēji, pilieni ar neapmierinošu valenci un līdz ar to mijiedarbībai pieejamiem proteīniem uzlādētiem reģioniem atvieglo koacervātam hidrofilās virsmas saplūšanu un mitrināšanu, lai samazinātu tās augsto virsmas enerģiju.Šī situācija ir vēlama αS / Tau441 koacervātiem, kuriem ir daudzvērtīgs komplekss tīkls, kas sastāv no vājām Tau-Tau un αS-Tau mijiedarbībām.Savukārt lielāki koacervāti vieglāk saglabās šķidrumam līdzīgās īpašības, ļaujot notikt citai proteīna-olbaltumvielu mijiedarbībai.Galu galā koacervāta šķidrumā veidojas amiloīda neviendabīgi agregāti, kas satur gan αS, gan tau, kas var būt saistīti ar tiem, kas atrodami ieslēguma ķermeņos, kas ir neirodeģeneratīvu slimību pazīmes.
Lielās šķidrumam līdzīgās struktūras, kas veidojas αS / Tau441 nobriešanas laikā ar ļoti pārslogotu, bet dinamisku olbaltumvielu vidi un mazākā mērā αS / ΔNt-Tau koacervātiem, ir ideāli rezervuāri olbaltumvielu agregācijas kodolu veidošanai.Mēs patiešām esam novērojuši cieto olbaltumvielu agregātu veidošanos šāda veida proteīnu koacervātos, kas bieži satur gan αS, gan tau.Mēs esam parādījuši, ka šos heteroagregātus stabilizē neelektrostatiska mijiedarbība, tie spēj saistīt amiloīdam specifiskās ThT krāsvielas tāpat kā tipiskas amiloīda fibrillas, un tiem patiešām ir līdzīga izturība pret dažādām ietekmēm.Tika pierādīts, ka LLPS veidotajiem αS / tau agregātiem ir amiloīdiem līdzīgas īpašības.Patiešām, nobriedušais Tau variants, kuram trūkst amiloīda agregācijas, ir ievērojami traucēts šo neviendabīgo αS agregātu veidošanā šķidrā elektrostatiskā koacervātā.αS/Tau441 agregātu veidošanās tika novērota tikai koacervātos, kas saglabāja šķidrumam līdzīgas īpašības, un nekad, ja koacervāti/pilieni nesasniedza gēla stāvokli.Pēdējā gadījumā palielināta elektrostatiskās mijiedarbības stiprums un līdz ar to proteīna tīkla stingrība novērš nepieciešamos proteīnu konformācijas pārkārtojumus, lai izveidotu jaunas proteīnu mijiedarbības, kas nepieciešamas amiloīda kodolu veidošanai.Tomēr to var panākt elastīgākos, šķidrumam līdzīgos koacervātos, kas, savukārt, visticamāk, paliks šķidri, palielinoties izmēram.
Fakts, ka agregātu veidošanās kondensētajā fāzē ir vēlama lielos αS / Tau kondensātos, nevis mazos pilienos, kas ātri saželē, uzsver to faktoru identificēšanas nozīmi, kas kontrolē pilienu saplūšanu.Tādējādi ir ne tikai tendence uz fāzu atdalīšanu, bet arī jākontrolē kondensāta lielums, lai tā darbotos pareizi, kā arī slimību profilakse58,61.Mūsu rezultāti arī uzsver LLPS un LSPT līdzsvara nozīmi αS / Tau sistēmā.Lai gan pilienu veidošanās var aizsargāt pret amiloīda agregāciju, samazinot piesātinājuma apstākļos pieejamo olbaltumvielu monomēru daudzumu, kā tas ir ierosināts citās sistēmās63, 64, pilienu saplūšana augstā pilienu līmenī var izraisīt iekšēju olbaltumvielu agregāciju, izmantojot lēnas konformācijas pārkārtošanās.proteīnu tīkli..
Kopumā mūsu dati stingri uzsver saliedētās valences un apmierinātās / neapmierinātās mijiedarbības nozīmi pilienu tīklos LSPT kontekstā.Jo īpaši mēs parādām, ka pilna garuma αS / Tau441 kondensāti spēj efektīvi sapludināt un veidot kodolu, veidojot amiloīdiem līdzīgus heteroagregātus, kas ietver gan proteīnus, gan ierosina molekulāro mehānismu, pamatojoties uz mūsu eksperimentālajiem rezultātiem.Divu proteīnu koagregācija αS/Tau šķidruma koacervātā, par ko mēs šeit ziņojam, patiešām var būt saistīta ar divu proteīnu līdzlokalizāciju ieslēgumos, kas ir slimības pazīmes, un var palīdzēt izprast attiecības starp LLPS un amiloīda agregācija, paverot ceļu augsti uzlādētai IDP neirodeģenerācijai.
Monomērie WT-αS, cisteīna mutanti (Q24C-αS, N122C-αS) un ΔCt-αS varianti (Δ101-140) tika ekspresēti E. coli un attīrīti, kā aprakstīts iepriekš.5 mM DTT tika iekļauts visos αS cisteīna mutantu attīrīšanas posmos, lai novērstu disulfīda saites veidošanos.Tau441 izoforma (plazmīda iegūta no Addgene #16316), ΔNt-Tau variants (Δ1–150, iegūts, klonējot IVA ar praimeriem CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) un AggDEf-1,75 attīrīts variants (GGDEF-1,7CTTamer) E. coli kultūras bija audzē līdz OD600 = 0, 6–0, 7 37 ° C temperatūrā un 180 apgr./min, un ekspresija tika ierosināta ar IPTG 3 stundas 37 ° C temperatūrā.Savāc šūnas ar ātrumu 11 500 xg 15 minūtes 4 °C temperatūrā un mazgā ar fizioloģisko buferšķīdumu, kas satur 150 mM NaCl.Atkārtoti suspendējiet granulu līzes buferšķīdumā (20 ml uz 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidīns 50 μM, 00 copeptin1M).Apstrāde ar ultraskaņu tika veikta uz ledus ar 80% amplitūdu 10 impulsiem (1 min ieslēgts, 1 minūte izslēgts).Nepārsniedziet 60 ml vienā ultraskaņā.E. coli lizātus karsēja 95°C temperatūrā 20 minūtes, pēc tam atdzesēja uz ledus un centrifugēja pie 127 000 x g 40 minūtes.Dzidrinātais supernatants tika uzklāts uz 3,5 kDa membrānas (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) un dializēts pret 4 l dialīzes buferšķīduma (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0,1 mM) 10 stundas.5 ml katjonu apmaiņas kolonna (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, ASV) tika līdzsvarota ar līdzsvara buferšķīdumu (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lizāts tika filtrēts caur 0, 22 μm PVDF filtru un ievadīts kolonnā ar plūsmas ātrumu 1 ml / min.Elucija tika veikta pakāpeniski, tau tika eluēts ar 15–30% eluēšanas buferšķīdumu (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Frakcijas tika analizētas ar SDS-PAGE, un visas frakcijas, kas satur vienu joslu ar paredzamo tau molekulmasu, tika koncentrētas, izmantojot 10 kDa centrifūgas filtru un aizstātas ar buferšķīdumu, kas satur 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM un DTT 2 mM. galīgā proteīna koncentrācija bija 100 μM.Pēc tam proteīna šķīdumu izlaida caur 0, 22 μm PVDF filtru, ātri sasaldēja un uzglabāja -80 ° C temperatūrā.Proteīnu K18 laipni nodrošināja prof. Alberto Boffi.Preparāta tīrība bija >95%, ko apstiprināja SDS-PAGE un MALDI-TOF/TOF.Dažādi cisteīni tika ķīmiski marķēti ar AlexaFluor488-maleimīdu (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ASV) vai TEMPOL-maleimīdu (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanāda).tika apstiprināti ar absorbciju un MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau un K18 tika marķēti ar dabiskām cisteīna atliekām 191. un 322. pozīcijā, izmantojot Atto647N-maleimīdu (ATTO-TEC GmbH, Zīgena, Vācija), ievērojot to pašu procedūru.Neto maksa par atlikumu αS un Tau441 kartes tika ģenerētas, izmantojot CIDER66.
Cietais poli-L-lizīns (pLK DP 90-110 saskaņā ar KMR no piegādātāja, Alamanda Polymers Inc, Hantsvila, Alabama, ASV) tika izšķīdināts 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH no 7,4 līdz 10 mM, process tika apstrādāts ar ultraskaņu 5 minūtes ultraskaņas ūdens vannā un uzglabāt -20°C.PEG-8, dekstrāns-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, ASV) un FITC-dekstrāns-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, ASV) ir ūdenī šķīstoši un plaši izplatīti LLPS buferšķīdumā.Dialīze noņem piesārņojošos sāļus.Pēc tam tos filtrēja caur šļirces filtru ar poru izmēru 0, 22 μm, un to koncentrācijas tika aprēķinātas, izmantojot refraktometru (Mettler Toledo, Columbus, Ohaio, ASV).LLPS paraugi tika sagatavoti istabas temperatūrā šādā secībā: tika sajaukts buferšķīdums un ekstrūzija un 1 mM tris(2-karboksietil)fosfīns (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etāns). 1,2-diildinitrils) tetraetiķskābe (EDTA, karboksints) un 1% proteāzes inhibitora maisījums (PMSF 100 mM, benzimīds 1 mM, leupeptīns 5 μM).Tad pievieno αS un sapludinātos polikationus (opcijas pLK vai Tau).Tioflavīna-T laikrindu eksperimentiem (ThT, Carbosynth, Compton, UK) izmantojiet kopējo ThT koncentrāciju, lai tā būtu puse no αS koncentrācijas.Viegli, bet rūpīgi samaisiet paraugus, lai tie būtu viendabīgi.Katra komponenta koncentrācija dažādos eksperimentos bija atšķirīga, kā aprakstīts sadaļā Rezultāti.Azīds tika izmantots 0,02% (w/v) koncentrācijā ikreiz, kad eksperimenta ilgums pārsniedza 4 stundas.Visām analīzēm, kurās izmanto LLPS paraugus, pirms analīzes ļaujiet maisījumam līdzsvaroties 5 minūtes.Gaismas izkliedes analīzei 150 µl paraugu tika ievietoti nesaistošās 96 bedrīšu mikroplatēs (µClear®, melna, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsminstere, Austrija) un pārklāti ar līmplēvi.LLP tika uzraudzīti, mērot absorbciju pie 350 nm šķīduma centrā CLARIOstar plākšņu lasītājā (BMG Labtech, Ortenberg, Vācija).Eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros 25 ° C temperatūrā, un kļūdas tika aprēķinātas kā standarta novirze no vidējā.Atšķaidītā fāze tika kvantitatīvi noteikta ar parauga centrifugēšanu un SDS-PAGE gēla analīzi, un αS frakcija atšķaidītā un koncentrētā fāzē tika kvantitatīvi noteikta dažādos LLPS šķīdumos.100 μl LLPS paraugu, kas satur 1 μM ar AF488 iezīmētu αS, sagatavoja, rūpīgi sajaucot, kam sekoja centrifugēšana pie 9600 × g 30 minūtes, pēc tam nogulsnes parasti bija redzamas.Augšējie 50 μl supernatanta tika izmantoti olbaltumvielu kvantitatīvai noteikšanai, izmantojot SDS-PAGE gēlu.Gēli tika skenēti ar AF488 filtriem, izmantojot ChemiDoc gēla attēlveidošanas sistēmu (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ASV) vai iekrāsoti ar Coomassie traipu un vizualizēti ar atbilstošiem filtriem.Iegūtās joslas tika analizētas, izmantojot ImageJ versiju 1.53i (Nacionālie veselības institūti, ASV).Eksperimenti tika veikti divos eksemplāros divos dažādos eksperimentos ar līdzīgiem rezultātiem.
Parasti 150 μl paraugu tika uzklāti uz nesaistošām 96 bedrīšu mikroplatēm un vizualizēti istabas temperatūrā ar Leica DMI6000B apgriezto mikroskopu (Leica Microsystems, Wetzlar, Vācija).Punktu eksperimentiem tika izmantotas arī µ-Slide Angiogenesis plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Vācija) vai 96 bedrīšu polistirola mikroplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).EL6000 halogēna vai dzīvsudraba metālu halogenīdu spuldzes tika izmantotas kā apgaismojuma avoti (attiecīgi BF/DIC un WF attēlveidošanai).WF mikroskopijai tika izmantots 40x palielinājuma gaisa objektīvs (Leica Microsystems, Vācija), lai fokusētu gaismu uz paraugu un savāktu to.AF488 un ThT marķētiem paraugiem filtrējiet ierosmi un emisiju ar standarta GFP filtru komplektiem, ierosmes un emisijas frekvenču joslas filtriem, attiecīgi 460–500 nm un 512–542 nm frekvenču joslas caurlaides filtriem un 495 nm dihromisko spoguli.Paraugiem, kas marķēti ar Atto647N, tika izmantots standarta Cy5 filtru komplekts ar ierosmes un emisijas frekvenču joslas filtriem attiecīgi 628–40 nm un 692–40 nm, kā arī 660 nm dihromiskais spogulis.BF un DIC mikroskopijai izmantojiet to pašu atstarotās gaismas savākšanas objektīvu.Savāktā gaisma tika ierakstīta Leica DFC7000 CCD kamerā (Leica Microsystems, Vācija).Ekspozīcijas laiks bija 50 ms BF un DIC mikroskopijas attēlveidošanai un 20–100 ms WF mikroskopijas attēlveidošanai.Salīdzinājumam, ekspozīcijas laiks visiem eksperimentiem ar ThT bija 100 ms.Tika veikti laika intervāla eksperimenti, lai vizualizētu pilienu saplūšanu, attēli tika savākti ik pēc 100 ms vairākas minūtes.Attēlu analīzei tika izmantots ImageJ (NIH, ASV).Eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros ar līdzīgiem rezultātiem.
Kolokalizācijas eksperimentiem, FRAP un 3D rekonstrukcijai attēli tika iegūti ar Zeiss LSM 880 apgriezto konfokālo mikroskopu, izmantojot ZEN 2 zilo izdevumu (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Vācija).50 µl paraugi tika uzklāti uz µ-Slide Angiogenesis Petri trauciņiem (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Vācija), apstrādāti ar hidrofilu polimēru (ibiTreat) un uzstādīti 63× eļļas imersijas objektīvā (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil). uz DIC).Attēli tika iegūti, izmantojot 458 nm, 488 nm un 633 nm argona lāzera līnijas ar izšķirtspēju 0,26 µm/pikselis un ekspozīcijas laiku 8 µs/pikselis ierosmes un emisijas noteikšanas logiem 470–600 nm, 493–628 nm, 628 nm. un 638–755 nm tika izmantoti, lai vizualizētu attiecīgi ThT, AF488 un Atto647N.FRAP eksperimentiem katra parauga fotografēšana ar laika intervālu tika reģistrēta ar ātrumu 1 kadrs sekundē.Eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros istabas temperatūrā ar līdzīgiem rezultātiem.Visi attēli tika analizēti, izmantojot Zen 2 zilā izdevuma programmatūru (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Vācija).FRAP līknes tika normalizētas, uzzīmētas un pielāgotas intensitātes/laika datiem, kas iegūti no attēliem, izmantojot Zen 2, izmantojot OriginPro 9.1.Atjaunošanās līknes tika pielāgotas monoeksponenciālam modelim, lai ņemtu vērā molekulāro difūziju ar papildu eksponenciālu terminu, lai ņemtu vērā ieguves balināšanas efektu.Pēc tam mēs aprēķinājām D, izmantojot nominālo balināšanas rādiusu un iepriekš noteikto atveseļošanās pusperiodu, kā norādīts Kang et al.Parādīts 5 35.
Atsevišķi αS cisteīna varianti tika sintezēti ar 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidīna-N-oksilu (TEMPOL) pozīcijās 24 (TEMPOL-24-αS) un 122 (TEMPOL-122-αS), attiecīgi.Spin marķēšana EPR eksperimentiem αS koncentrācija tika iestatīta uz 100 μM un PEG koncentrācija bija 15% (w/v).Dažādos agregācijas apstākļos αS: pLK attiecība bija 1:10, savukārt αS: ΔNt-Tau un αS: Tau441 attiecība tika saglabāta 1:1.Saistīšanas titrēšanas eksperimentiem, ja nebija drūzmēšanās, TEMPOL-122-αS tika uzturēts pie 50 μM, un polikationi tika titrēti pieaugošās koncentrācijās, sagatavojot katru stāvokli atsevišķi.CW-EPR mērījumi tika veikti, izmantojot Bruker ELEXSYS E580 X-joslas spektrometru, kas aprīkots ar Bruker ER4118 SPT-N1 rezonatoru, kas darbojas ar mikroviļņu (SHF) frekvenci ~ 9, 7 GHz.Temperatūra tika iestatīta uz 25 ° C un kontrolēta ar šķidrā slāpekļa kriostatu.Spektri tika iegūti nepiesātinātos apstākļos ar MW jaudu 4 mW, modulācijas amplitūdu 0, 1 mT un modulācijas frekvenci 100 kHz.Spektrālās intensitātes tika normalizētas, lai izvairītos no atšķirībām griešanās koncentrācijās starp paraugiem un iespējamu griešanās samazināšanos, ko izraisa reducētāju atlikušās koncentrācijas paraugos, kas satur Tau441 vai ΔNt-Tau (kas atrodas sākotnējos proteīna šķīdumos).Dotās g vērtības tika iegūtas EPR spektrālās modelēšanas rezultātā, kas veikta, izmantojot Easyspin programmatūru (v. 6.0.0-dev.34), kas realizēta Matlab®67.Datu modelēšanai tika izmantoti viena/divu komponentu izotropiskie modeļi.Pēc visu signālu normalizēšanas atlikumi tika aprēķināti, atņemot katru simulāciju no atbilstošā eksperimentālā spektra.Saistīšanas titrēšanas analīzei tika izmantota trešās joslas relatīvā intensitāte pret normalizētā EPR spektra otro joslu (IIII / III), lai uzraudzītu polikationu saistīšanos ar αS.Lai novērtētu disociācijas konstanti (Kd), iegūtā līkne tika piemērota aptuvenam modelim, pieņemot, ka n identiskas un neatkarīgas saistīšanās vietas.
KMR spektroskopijas eksperimenti tika veikti, izmantojot Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spektrometru, kas aprīkots ar kriozondi un Z-gradientu.Visi eksperimenti tika veikti, izmantojot 130–207 µM αS un atbilstošos αS/ΔNt-Tau un pLK ekvivalentus 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4, un tika veikti 15 °C temperatūrā.Lai kontrolētu LPS ar KMR, iepriekš sajauktajiem paraugiem tika pievienots 10% PEG.Ķīmiskās nobīdes traucējumu diagramma (1.b att.) parāda vidējās 1H un 15N ķīmiskās nobīdes.αS 2D1H-15N HSQC spektri tika piešķirti, pamatojoties uz iepriekšējo piešķiršanu (BMRB ieraksts # 25227), un apstiprināti, reģistrējot un analizējot HNCA, HNCO un CBCAcoNH 3D spektrus.13Cα un 13Cβ ķīmiskās nobīdes tika aprēķinātas ΔNt-Tau vai pLK klātbūtnē, lai izmērītu iespējamās izmaiņas sekundārās struktūras tendencēs, salīdzinot ar αS ķīmiskajām nobīdēm tīrā nejaušā spoles konformācijā 68 (papildu attēls 5c).R1ρ likmes tika mērītas, reģistrējot hsqctretf3gpsi eksperimentus (iegūti no Bruker bibliotēkas) ar 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 un 800 ms aizkavi, un eksponenciālās funkcijas tika pielāgotas pīķa aizkavei ar dažādu intensitāti. reizes, lai noteiktu R1ρ un tā eksperimentālo nenoteiktību.
Divu krāsu laika izšķirtspējas fluorescences mikroskopijas eksperimenti tika veikti ar komerciālu laika izšķirtspēju MT200 fluorescences konfokālo mikroskopu (PicoQuant, Berlīne, Vācija) ar laika korelācijas viena fotonu skaitīšanas (TCSPC) ierīci.Lāzera diodes galvu izmanto impulsa interleaved ierosmei (PIE), stars iet caur viena režīma viļņvadu un ir noregulēts uz lāzera jaudu no 10 līdz 100 nW 481 nm un 637 nm lāzera līnijām, kas mērītas pēc dihromiskā spoguļa.Tas nodrošina optimālu fotonu skaitīšanas ātrumu, izvairoties no fotonu aliasing, fotobalināšanas un piesātinājuma ietekmes.μ-Slide angiogēzes pārklājumi vai plāksnes (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Vācija) tika ievietotas tieši iegremdējamā ūdenī virs Super Apochromat 60x NA 1.2 objektīva ar koriģējošu apkakli (Olympus Life Sciences, Waltham, ASV).Kā galvenā stara sadalītājs tika izmantots 488/640 nm dihromiskais spogulis (Semrock, Lake Forest, IL, ASV).Nefokusētu starojumu bloķē caurums ar diametru 50 mikroni, tad fokusētais starojums tiek sadalīts 2 noteikšanas ceļos ar 50/50 staru sadalītāju.Detektora priekšā tika izmantoti joslas emisijas filtri (Semrock, Lake Forest, IL, ASV) 520/35 zaļajai krāsai (AF488) un 690/70 sarkanajai krāsai (Atto647N).Kā detektori tika izmantotas viena fotona lavīnas diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolcāno, Itālija).Gan datu vākšana, gan analīze tika veikta, izmantojot komerciāli pieejamo SymphoTime64 programmatūru (PicoQuant GmbH, Berlīne, Vācija).
Piecdesmit mikrolitri LLPS paraugu tika uzklāti uz μ-Slide angioģenēzes iedobēm (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Vācija).Iegūtie attēli tiek fokusēti līdz 20 µm virs akas dibena, lai nodrošinātu optimālu objektīva darba attālumu suspendētiem pilieniem, un līdz ~ 1 µm plostiem un punktiem ar aksiālo izšķirtspēju vismaz 0,25 µm/pikselis un aizkaves laiku 400 µs/pikselī.Atlasiet datus, piemērojot intensitātes slieksni, pamatojoties uz vidējo fona signāla intensitāti (PBG, vidējais + 2σ) katram kanālam, lai tiktu atlasīti tikai šķidro olbaltumvielu pilieni, plosti vai plankumi, filtrējot jebkuru iespējamo izcelsmi no izkliedētās fāzes.Lai analizētu katra kanāla katras sugas (τ) dzīves ilgumu (zaļš, “g” AF488 un sarkans, “r” Atto647N), mēs izvēlējāmies interesējošos reģionus (ROI), kas satur pilienus, plostus vai plankumus (1. papildu attēls). ).8b) un atvasināja tos, pielāgojot to kalpošanas laika samazināšanos (attiecīgi τD, τR un τP pilieniem, plostiem vai plankumiem, skatīt 8.c papildu attēlu) katrā kanālā, izmantojot astes piemērotības analīzi un divkomponentu samazinājuma modeli.Vidējais τ no τ .ROI, kas radīja pārāk maz fotonu daudzeksponenciālai atbilstībai, tika izslēgti no analīzes.Izmantotā robežvērtība bija <104 fotoni plostiem un punktiem un 103 fotoni kritieniem.Pilieniem ir zemāks slieksnis, jo ir grūti iegūt sabrukšanas līknes ar augstākām intensitātes vērtībām, jo ​​pilieni attēla laukā parasti ir mazāki un mazāk daudz.ROI, kuru fotonu skaits pārsniedz fotonu uzkrāšanās robežu (iestatīts uz > 500 skaitiem/pikseļi), arī tika izmesti analīzei.Saskaņojiet intensitātes samazināšanās līkni, kas iegūta no interesējošā apgabala ar intensitāti 90% no maksimālās (nedaudz pēc maksimālās samazināšanās intensitātes) no kalpošanas laika sākuma, lai nodrošinātu minimālus IRF traucējumus, vienlaikus saglabājot to pašu visu intensitātes samazināšanos. iestatījumi Relatīvais laika logs Tika analizēti 25 līdz 50 ROI plostiem un plankumiem un 15-25 ROI pilieniem, attēli atlasīti no vairāk nekā 4 atkārtojumiem, kas ierakstīti no vismaz 3 neatkarīgiem eksperimentiem.Divpusēji t testi ir izmantoti, lai novērtētu statistiskās atšķirības starp sugām vai starp koacervācijas sistēmām.Lai veiktu mūža analīzi pa pikseļiem (τ), tika aprēķināts kopējais kalpošanas laika vājināšanās laukā katram kanālam un tika veikta 2/3 komponentu eksponenciālās vājināšanās modeļa tuvināšana.Pēc tam katra pikseļa kalpošanas laika vājināšanās tika pielāgota, izmantojot iepriekš aprēķinātās τ vērtības, kā rezultātā tika iegūts pseidokrāsains FLIM piemērots attēls.Astes pielāgošanas mūža diapazons bija vienāds visiem viena kanāla attēliem, un katrs samazinājums radīja pietiekami daudz fotonu, lai nodrošinātu uzticamu piemērotību.FRET analīzei pikseļi tika atlasīti, piemērojot zemāku 100 fotonu intensitātes slieksni, kas vidējo fona signālu (FBG) veidoja 11 fotonu.Katra kanāla fluorescences intensitāte tika koriģēta ar eksperimentāli noteiktiem korekcijas koeficientiem: 69 spektrālā šķērsruna α bija 0,004, tiešās ierosmes β bija 0,0305, detektēšanas efektivitāte γ bija 0,517.Pēc tam FRET efektivitāti pikseļu līmenī aprēķina, izmantojot šādu vienādojumu:
kur FDD ir fluorescences intensitāte, kas novērota donora (zaļajā) kanālā, FDA ir fluorescences intensitāte, kas novērota akceptora (sarkanajā) kanālā ar netiešu ierosmi, un FAA ir fluorescences intensitāte, kas novērota akceptora (sarkanajā) kanālā tiešā ierosmē ( PIE).Kanālā tiek novēroti fluorescences intensitātes impulsi).
Ievietojiet 100 µl LLPS reakcijas šķīdumu, kas satur 25 µM neiezīmētu monomēru Tau441 (ar vai bez 25 µM αS) LLPS buferšķīdumā (papildināts, kā norādīts iepriekš) uz nesaistošām 96 iedobju mikroplatēm ar līmplēves pārklājumu un pilienu veidošanās pārbaudi pēc WF mikrokopijas. līdzsvarošana.10 min laikā.Pēc 48 stundu inkubācijas istabas temperatūrā tika apstiprināta olbaltumvielu plostu un plankumu klātbūtne.Pēc tam uzmanīgi noņemiet šķidrumu pāri plostiem no iedobēm, pēc tam pievienojiet 50 l disociācijas buferšķīduma (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) un inkubējiet 10 minūtes.Augstā sāls koncentrācija nodrošina, ka LLPS neatkārtosies atlikušā PEG dēļ, un tiks izjaukti iespējamie proteīnu komplekti, kas veidojas tikai elektrostatiskās mijiedarbības rezultātā.Pēc tam iedobes dibenu rūpīgi nokasīja ar mikropipetes galu un iegūto šķīdumu pārnesa uz tukšu novērošanas iedobi.Pēc paraugu inkubācijas ar 50 μM ThT 1 stundu izolētu plankumu klātbūtne tika pārbaudīta ar WF mikroskopiju.Sagatavo ar ultraskaņu apstrādātas αS fibrillas, inkubējot 300 µl 70 µM αS šķīduma PBS ar pH 7,4, nātrija azīdu 0,01% 37 °C temperatūrā un 200 apgr./min orbitālajā kratītājā 7 dienas.Pēc tam šķīdumu centrifugēja ar ātrumu 9600 × g 30 minūtes, granulu atkārtoti suspendēja PBS pH 7,4 un apstrādāja ar ultraskaņu (1 min, 50% cikls, 80% amplitūda Vibra-Cell VC130 sonikatorā, Sonics, Ņūtona, ASV) fibrilu paraugus. ar salīdzinoši vienmērīgu mazu fibrilu izmēru sadalījumu.
FCS / FCCS analīze un divu krāsu sakritības noteikšana (TCCD) tika veikta ar to pašu MT200 laika izšķirtspēju fluorescējošo konfokālo mikroskopu (Pico-Quant, Berlīne, Vācija), ko izmantoja FLIM-FRET mikroskopijas eksperimentos, izmantojot PIE režīmu.Lāzera jauda šiem eksperimentiem tika pievienota 6,0 µW (481 nm) un 6,2 µW (637 nm).Šo lāzera jaudu kombinācija tika izvēlēta, lai radītu līdzīgu spilgtumu izmantotajiem fluoroforu pāriem, vienlaikus panākot optimālus skaitīšanas ātrumus un izvairoties no fotobalināšanas un piesātinājuma.Gan datu vākšana, gan analīze tika veikta, izmantojot komerciāli pieejamo SymphoTime64 versiju 2.3 programmatūru (PicoQuant, Berlīne, Vācija).
Izolētu αS/Tau agregātu paraugus, kas iegūti, izmantojot LLPS, atšķaida izolācijas buferšķīdumā līdz atbilstošai monomolekulārajai koncentrācijai (parasti atšķaidījumam 1:500, jo agregāti jau ir zemā koncentrācijā, kad tos izolē no koacervāta paraugiem).Paraugi tika uzklāti tieši uz segstikliņiem (Corning, ASV), kas iepriekš pārklāti ar BSA šķīdumu koncentrācijā 1 mg / ml.
PIE-smFRET analīzei zaļajos un sarkanajos kanālos tika piemērots zemāks 25 fotonu intensitātes slieksnis, lai filtrētu zemas intensitātes signālus, ko izraisījuši monomēri notikumi (ņemiet vērā, ka monomēru skaits pārsniedz apkopoto paraugu skaitu, salīdzinot ar izolētiem agregātiem).Šis slieksnis tika aprēķināts kā piecas reizes lielāka par monomēra αS vidējo intensitāti, kas iegūta, analizējot tīru monomēru paraugus, lai īpaši atlasītu agregātus analīzei.PIE piedziņas ķēde kopā ar TSCPC datu ieguvi ir ļāvusi izmantot mūža svēršanas filtru, kas palīdz novērst fona un spektrālo šķērsrunu.Uzliesmojuma intensitāte, kas izvēlēta, izmantojot iepriekš minētos sliekšņus, tika koriģēta, izmantojot vidējo fona signālu, kas noteikts no notikumu histogrammām, salīdzinot ar tikai buferšķīduma paraugu intensitāti/tvertni.Pārrāvumi, kas saistīti ar lieliem agregātiem, parasti aizņem vairākas secīgas tvertnes laika trasē (iestatīta uz 1 ms).Šajos gadījumos tika izvēlēta maksimālā stiprība.FRET un stehiometriskajai analīzei tika izmantots teorētiski noteiktais gamma koeficients γ (0,517).Spektrālā šķērsruna un tiešās ierosmes ieguldījums ir niecīgs (noteikts eksperimentāli) pie izmantotās ierosmes lāzera jaudas.FRET efektivitāti un stehiometriju sprādzienā aprēķina šādi.