347 nerūsējošā tērauda tinumu cauruļu ķīmiskā sastāvdaļa, jaunu uz interferonu reaģējošu cilvēka leikocītu antigēna-A (HLA-A) chaperona proteīnu identificēšana, izmantojot šķērssaistīto masas spektrometriju (CLMS)

Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Turklāt, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs rādām vietni bez stiliem un JavaScript.
Slīdņi, kas parāda trīs rakstus katrā slaidā.Izmantojiet pogas Atpakaļ un Nākamais, lai pārvietotos pa slaidiem, vai slaidu kontrollera pogas beigās, lai pārvietotos pa katru slaidu.

Produkta apraksts

Nerūsējošā tērauda 347L spoles, tērauda marka: SS347L

Interferona signalizācijas sistēma izraisa spēcīgu citokīnu reakciju uz plašu patogēno un raksturīgo patoloģisko signālu klāstu no vides, kā rezultātā tiek inducētas ar interferonu inducējamu proteīnu apakškopas.Mēs izmantojām DSS-mediētu šķērssaites masas spektrometriju (CLMS), lai noteiktu jaunas proteīna-olbaltumvielu mijiedarbības interferona izraisīto proteīnu domēnā.Papildus paredzamajiem ar interferonu inducējamiem proteīniem mēs identificējām arī jaunus starpmolekulārus un intramolekulārus šķērssaistītus kanonisko interferonu inducējamo proteīnu adduktus, piemēram, MX1, USP18, OAS3 un STAT1.Mēs koncentrējāmies uz HLA-A proteīnu (H2BFS-HLA-A-HMGA1) veidotu jaunu interferonu inducējamu proteīnu tīklu ortogonālu validāciju, izmantojot līdzimunoprecipitāciju, un to turpmāko izpēti, izmantojot molekulārās dinamikas modelēšanu.Olbaltumvielu kompleksa konformācijas dinamikas modelēšana atklāja vairākas mijiedarbības vietas, kas atspoguļoja CLMS atklājumos identificētās mijiedarbības.Kopā mēs piedāvājam CLMS izmēģinājuma pētījumu, lai identificētu jaunus interferona izraisītus signālu kompleksus, un ceram uz plašāku CLMS izmantošanu, lai noteiktu jaunu olbaltumvielu mijiedarbības dinamiku audzēja mikrovidē.
Pirms adaptīvās imūnās atbildes reakcijas sākuma saimnieka iedzimtā aizsardzības sistēma veido pretmikrobu reakciju, ko mediē izdalīto alfa-spirālveida citokīnu saime, ko sauc par interferoniem (IFN).I tipa IFN klases IFNα un IFNβ aktivizē šūnu reakcijas, tostarp pretvīrusu, proapoptotisku, proinflammatorisku un antiproliferatīvu stāvokli.Cilvēkiem ir zināmi 13 IFNα apakštipi, kas visi ir grupēti 91. hromosomā. Pārsteidzoši, tikai IFNα2 ir pētīts klīniskai lietošanai.Pēdējā laikā īpaša uzmanība tiek pievērsta citu IFNα apakštipu pētījumiem.Nesenais pētījums parādīja, ka IFNα14 ir viena no efektīvākajām izoformām HBV2 un HIV-13,4 replikācijas ierobežošanā salīdzinājumā ar kanonisko IFNα2 apakštipu.
Konstatēts, ka aktivēti I tipa interferona receptoru kompleksi (IFNAR1 un IFNAR2) izraisa signālu transdukcijas kaskādi, ko mediē Janus kināzes TYK2 un JAK15,6.Šīs Janus kināzes fosforilē signālu devējus un transkripcijas proteīnu aktivatorus (STAT1 un STAT2) uz tirozīna atlikumiem, lai uzsāktu SH2 domēna mediētu heterodimerizāciju6.Pēc tam IRF9 saistās ar STAT heterodimēriem, veidojot IFN stimulētā 3. faktora gēna (ISGF3) trimerisko kompleksu, kas pārceļas uz kodolu un inducē vairāk nekā 2000 interferona stimulētu gēnu (ISG) transkripciju5,6,7,8.
ISG veido iedzimtas imūnsistēmas mugurkaulu, īpaši reaģējot uz vīrusu uzbrukumu.Kā pirmā aizsardzības līnija pret vīrusu infekciju šūnas ātri izvērš plašu šūnu proteīnu mijiedarbību ar plašu bioloģisko aktivitāšu klāstu.Šie proteīni ietver modeļu atpazīšanas receptorus, signalizācijas molekulas, transkripcijas faktorus un proteīnus ar tiešām pretvīrusu funkcijām, kā arī negatīvus imūnreakciju regulatorus9.Liela daļa informācijas par ISG aktivitāti nāk no funkcionāliem ekrāniem, izmantojot pārmērīgas ekspresijas ekrānus 10, 11 vai gēnu klusēšanas metodes (siRNA, RNAi un CRISPR) 12, 13, kuros atsevišķi ISG tiek ekspresēti vai inhibēti un to aktivitāte tiek pārbaudīta ar dažādiem vīrusiem.Lai gan šie pētījumi ir noteikuši atsevišķu ISG pretvīrusu īpašības, katra ISG pamatā esošie molekulārie mehānismi lielākoties nav zināmi.Ir vispāratzīts, ka daudzi proteīni mijiedarbojas ar vienu vai vairākiem citokīniem, lai nodrošinātu pilnīgu aktivitāti, tāpēc vai nu ISG mijiedarbojas tieši, vai arī to mijiedarbību veic šūnu proteīni.Piemēram, nesen veiktā fotokrosssaistītā proteomikas pētījumā tika konstatēts, ka ATPase VCP/p97 ir galvenais IFITM3 mijiedarbības partneris, kura inhibīcija izraisa defektus IFITM3 lizosomu šķirošanā, apgrozībā un līdztransportā ar vīrusu daļiņām 14 .Izmantojot imunoprecipitāciju, mēs identificējām VAPA, ar pūslīšu saistītu proteīnu, kā mijiedarbības partneri ar IFITM1 / 2/3, kas veicina holesterīna izraisītu vīrusu nobriešanu, un to apstiprināja cits pētījums, izmantojot rauga divu hibrīdu sistēmu.Zinātniskais atbalsts 15 , 16 .
Galvenais bioloģiskais process, kas saistīts ar infekcijas un ļaundabīgo transformāciju nomākšanu, ir antigēna prezentācija, ko veicina galvenās histokompatibilitātes kompleksa (MHC) molekulas.Peptīdi (8-12 aminoskābes gari) no šķeltiem, priekšlaicīgi pārtrauktiem vai nepareizi salocītu proteīnu tiek ievietoti MHC-I heterodimērā (sastāv no MHC-I smagajām un vieglajām ķēdēm, ko sauc par β-2-mikroglobulīnu; β2M) 17,18 .Iegūtie stabilie MHC-I trimeri tiek transportēti uz šūnu virsmu, kur tie prezentē intracelulāros peptīdus CD8+ T šūnām (citotoksiskām T šūnām)17.T šūnas atpazīst un iznīcina šos patogēnus un šūnas, kas satur audzējam specifisku antigēnu.Līdz ar to patogēni un audzēja šūnas bieži nomāc antigēna prezentācijas procesu, lai izvairītos no imūnās uzraudzības.Turklāt MHC-I tiek samazināts 40–90% cilvēku audzēju, un tas bieži ir saistīts ar sliktāku prognozi19.
Gēniem, kas iesaistīti reakcijā uz patogēniem, ātri jāpārslēdzas starp miera stāvokli un aktīvās transkripcijas stāvokli.Tāpēc tiek pieņemts, ka vairāki šūnu proteīni ir iesaistīti reakcijā uz augstu IFN pieprasījumu īsā laika periodā, tostarp promotora hromatīna 20, 21 pārveidošanā un modifikācijā.Lielākā daļa pētījumu ir vērsti uz atsevišķu ISG proteīna partneru identificēšanu IFN klātbūtnē.Vairāki proteomiski un transkriptomiski pētījumi modeļu šūnu sistēmās ir noskaidrojuši IFN ietekmi uz šūnu ainavu.Tomēr, neskatoties uz pieaugošo izpratni par interferonu izraisīto dinamiku, mēs joprojām maz zinām par ISG iesaistīšanos.Apsverot interferona signalizācijas sarežģītību un laika atkarīgo dinamiku, rodas divi jautājumi: (i) vai ir iespējams stabilizēt un notvert daudzproteīnu kompleksus, kas iesaistīti ātrā signalizācijā, un (ii) vai šīs mijiedarbības var kartēt 3D telpā?
Lai risinātu šīs problēmas, mēs ieviesām disukcinimīda suberātu izraisītu ķīmisko šķērssavienojumu (DSS) kopā ar masas spektrometriju (CLMS), lai izpētītu IFNα izraisīto olbaltumvielu mijiedarbības tīklu un tā dinamiku.DSS pievieno kovalentās saites starp proteīnu proksimālajiem atlikumiem un/vai proteīnu kompleksiem in vivo.Turpmākā MS analīze atklāj specifiskas šķērssaistīšanas vietas, kas atspoguļo reģionu telpisko tuvumu noteiktā proteīnā, ko sauc par iekšējām saitēm vai apakšvienībām proteīnu kompleksos, ko sauc par savstarpējām attiecībām.Izmantojot šo pieeju, mēs esam identificējuši vairākus jaunus proteīna-olbaltumvielu kompleksus, kā arī interferona izraisītus daudzproteīnu mijiedarbības tīklus.Tālāk pārbaudot šo jauno mijiedarbību apakškopu, mēs parādām, ka H2BFS (H2B histona tipa FS; turpmāk saukts par H2B) un MDN1 darbojas kā HLA-A saistošie partneri.
Flo-1 šūnas ir viens no pazīstamākajiem barības vada adenokarcinomas in vitro modeļiem, jo ​​tie atdarina barības vada audzēju galvenās iezīmes 22, 23.Tomēr ne visi audzēji ir imunogēni, un, lai noteiktu, vai Flo-1 šūnas reaģē uz ārstēšanu ar interferonu, mēs apstrādājām Flo-1 šūnas ar 10 ng / ml IFNα 72 stundas.Flo-1 šūnas uzrādīja agrīnu pSTAT1 un IRF1 indukciju, sākot 2 stundas pēc apstrādes un turpinot 72 stundas, ar laika atkarīgu IRF1 stacionārā līmeņa pazemināšanos (1.A attēls).Tika konstatēts, ka ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 un ISG15) ir spēcīgi inducēti pēc 6 stundām, atdarinot klasiskās vidējās un vēlīnās fāzes reakcijas uz IFNα (1.A attēls).Kopā šie dati liecina, ka šo šūnu modeli var izmantot, lai pētītu interferona atbildes reakcijas.
Diferenciālas olbaltumvielu ekspresijas reakcijas Flo-1 šūnās pēc IFNα apstrādes.(A) Olbaltumvielu ekspresija Flo-1 šūnās, kas apstrādātas ar 10 ng/ml IFNα 2, 6, 24, 48 un 72 stundas, tika analizēta ar imūnblotu, izmantojot norādītās ISG antivielas.(B) Coomassie Blue krāsoti veselu šūnu ekstraktu SDS-PAGE gēli pēc šķērssaistīšanas ar DSS norādītajiem laikiem un koncentrācijām.(C) Reprezentatīvs imūnblots, kas pārbaudīts ar p53 (DO-1) antivielu no tiem pašiem paraugiem, lai novērtētu proteīnu šķērssavienojuma pakāpi.
Lai attēlotu in situ proteīnu mijiedarbības ainavu, mēs izmantojām DSS, plaši izmantotu šķērssaistīšanas līdzekli, pateicoties tā augstajai membrānas caurlaidībai un salīdzinoši īsajam reakcijas laikam.Īsāks reakcijas laiks palīdz novērst lielu šķērssaistītu proteīnu agregātu veidošanos, tādējādi saglabājot šķērssaistītāja stabilitāti.Lai noteiktu optimālo DSS koncentrāciju un izvairītos no pārmērīgas šķērssaistīšanas, mēs vispirms pakļāvām šūnas 5, 2,5 un 1 mM DSS iedarbībai attiecīgi 5, 10, 5 un 30 minūtes un analizējām lizātus ar Kumassi krāsotu SDS-PAGE. (dati netiek parādīti) .Šķiet, ka šūnu lizāti ir ļoti savstarpēji saistīti zemākajā koncentrācijā un īsākā laika punktā.Tāpēc DSS tika titrēts līdz 1, 0,5 un 0,1 mM 5 minūšu laikā (1.B attēls).Optimāla šķērssaistīšana tika novērota ar 0, 5 mM DSS 5 minūtes, un šie apstākļi tika izvēlēti šūnām, kas apstrādātas ar IFNα.Turklāt 1.C attēlā parādīts Western blots, kas veikts, izmantojot p53 (DO-1) antivielu, lai novērtētu proteīnu šķērssaistīšanas pakāpi.
Pirms šķērssaistītāja pievienošanas Flo-1 šūnas 24 stundas apstrādāja ar 10 ng/ml IFNα.Šķērssaistītās šūnas pēc tam tika lizētas ar divpakāpju proteolīzi, un olbaltumvielas tika apstrādātas ar FASP (2. att.)24,25.Šķērssaistītie triptiskie peptīdi tika analizēti ar masas spektrometriju (2. att.).Pēc tam MS/MS spektri tiek saskaņoti ar proteīna secību un kvantitatīvi noteikti ar MaxQuant26,27.No iegūtajiem spektriem, izmantojot SIM-XL programmu, tika identificēti šķērssaistītie peptīdi, un atsevišķi savienojumi tika apvienoti kompleksā tīklā, izmantojot xQuest28 un SIM-XL29 atvērtā pirmkoda skaitļošanas programmatūras konveijerus (2. att.).SIM-XL identificē olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbību, iekšējās ķēdes un atsevišķas ķēdes vienkāršos vai sarežģītos proteīnu maisījumos un nodrošina skriptus mijiedarbības vizualizācijai olbaltumvielu struktūrās.Turklāt tā sarindo katru savstarpējo atsauci kā ID punktu atbilstoši MS/MS29 spektra kvalitātei.Ir identificētas vairākas ļoti uzticamas proteīna-olbaltumvielu mijiedarbības un kompleksi, kā arī tālāk pētīts jauns mijiedarbības kopums, izmantojot līdzimunoprecipitāciju un kompleksu konformācijas izmaiņas, izmantojot molekulārās dinamikas (MD) modelēšanu (2. att.) 30, 31.
CLMS metodes shematisks pārskats.Flo-1 šūnas tika apstrādātas ar 10 ng/ml IFNα 24 stundas, kam sekoja in situ proteīnu šķērssaistīšana, izmantojot DSS, kam sekoja šūnu līze un tripsinizācija.Šķērssaistītie paraugi tika analizēti, izmantojot Orbitrap masas spektrometru, un tālāk tika ņemti paraugi peptīdu prekursoru fragmentācijai LC-MS/MS laikā.No iegūtajiem spektriem tika identificēti divi saistīti peptīdi, izmantojot programmu Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL), un visi savienojumi tika apvienoti sarežģītā tīklā, izmantojot skaitļošanas cauruļvadus.Filtrējiet zemas ticamības mijiedarbības, pamatojoties uz viltus pozitīvo rādītāju (FDR) rādītājiem.Vairākas jaunas augstas precizitātes proteīnu un olbaltumvielu mijiedarbības tika tālāk apstiprinātas, izmantojot līdzimunoprecipitāciju, un kompleksu konformācijas izmaiņas tika pārbaudītas, izmantojot molekulārās dinamikas (MD) modelēšanu.
Izmantojot MaxQuant, attiecīgi nestimulētos un stimulētos IFNα paraugos tika atklāti ~ 30 500 un ~ 28 500 peptīdu (papildu tabula S1, 3. att.).Peptīdu garuma sadalījums abos gadījumos uzrādīja lielāku lielāku peptīdu īpatsvaru, kas norāda uz šķērssaistītu peptīdu klātbūtni (3.B, C att.).Turklāt lielāka daļa lielāku peptīdu bija klāt 40–55 diapazonā ar IFNα apstrādātajos paraugos (3. att. C).Vairāk nekā trīs reizes bagātinātu proteīnu ceļu analīze, reaģējot uz ārstēšanu ar IFNα, izmantojot Reactome ceļa datubāzi, parādīja, ka MHC-I mediētā antigēna prezentācija un apstrāde bija dominējošais ceļš (3.E attēls).Saskaņā ar iepriekšējiem ziņojumiem viens no aktivizētajiem ceļiem bija pretvīrusu atbildes reakcijas, ko mediē OAS un ISG15, kā arī IFNα / β un citokīnu signalizācija.Turklāt, izmantojot SIM-XL, no sākotnēji iegūtajiem MS / MS spektriem tika identificētas lizīnam un serīnam specifiskas olbaltumvielu šķērssaites.Nesenā pētījumā tika ziņots par 104 ISG, kas aptver 20 vīrusus no 9 vīrusu klasēm, veicot atsevišķu ISG pārmērīgas ekspresijas pētījumu metaanalīzi 5 šūnu tipos9.Tomēr, lai pārvarētu lielu datu kopu skrīninga skaitļošanas ierobežojumus, mēs sākām ar mazāku datu kopu, lai izpētītu iespējamo mijiedarbību starp IRDS gēnu sarakstu, par ko ziņoja Padaria et al., no kuriem lielākā daļa ir ISG.
Atšķirīgi izteiktu šķērssaistītu proteīnu identificēšana, reaģējot uz IFNα (dati iegūti no MaxQuant).(A) Venna diagramma, kas attēlo parasto un ekskluzīvo peptīdu skaitu, kas identificēti ar IFNα14 apstrādātajos un neapstrādātajos Flo-1 paraugos.Neapstrādātu (B) un ar IFNα apstrādātu (C) šķērssaistītu paraugu peptīdu garuma sadalījums.(D) Siltuma karte, kas attēlo log2 (LFQ intensitāti) starp neapstrādātām un ar IFNα14 apstrādātām Flo-1 šūnām.Kreisajā panelī ir parādīti proteīni, kas visaktīvāk tiek aktivizēti IFNα klātbūtnē.(E) Histogramma, kas attēlo 20 galvenos bagātināšanas ceļus pēc IFNα apstrādes.Reactome ceļa datu bāze analizēja vairāk nekā četras reizes lielākas izmaiņas uz IFNα reaģējošajos proteīnos.
Interferona mediētā ISG stimulācija ir labi dokumentēta, taču molekulārā līmenī ir slikti saprotams, kā šie proteīni kulminē ar plašu bioloģisko funkciju klāstu.Mēs pētījām proteīnu mijiedarbību ar augstu ticamības pakāpi starp zināmajiem ISG.Interesanti, ka mēs identificējām tīklu, kas ietver MX1, USP18, ROBO1, OAS3 un STAT1 proteīnus, kas veido lielu kompleksu, reaģējot uz IFNα ārstēšanu (4. attēls, S2 tabula) 32, 33, 34.Vissvarīgākais ir tas, ka šīs mijiedarbības tika konstatētas visos trīs eksemplāros, kas tika ārstētas ar IFNα, un tās netika konstatētas neapstrādātos paraugos, kas liecina, ka tās veidojās īpaši, reaģējot uz ārstēšanu ar IFNα.Ir zināms, ka STAT1 transkripcijas ceļā regulē šo ISG ekspresiju, taču tā mijiedarbība ar ISG proteīna līmenī nav pētīta.Šīs α-spirāles veido spirālveida spirāles struktūru, kas nodrošina pārsvarā hidrofilu virsmas laukumu mijiedarbībai 35 .Savos CLMS datos mēs novērojām, ka lielākā daļa mijiedarbības ar STAT1 notika SH2 domēnā pirms CCD, linkera domēna vai C-gala astes (atlikumi 700-708) (4.A attēls).Iepriekšējā pētījumā tika ziņots, ka USP18 saistās ar STAT2 CCD un DNS saistošo domēnu (DBD) un tiek pieņemts darbā I tipa interferona receptora IFNAR2 apakšvienībā, lai veicinātu I tipa interferona signālu inhibīciju24.Mūsu dati arī parādīja, ka USP18 katalītiskais domēns mijiedarbojas ar STAT1 DBD (4.A, D attēls), kas liecina, ka gan STAT1, gan STAT2 var spēlēt lomu USP18 piesaistīšanā IFNAR2.
Olbaltumvielu-olbaltumvielu ISG tīkls, kas identificēts šķērssaistītās šūnās, kas apstrādātas ar IFNα.(A) 2D mijiedarbības grafiks, kurā parādīta olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbība (ģenerēta SIM-XL programmā) ar līnijām, kas attēlo starpmolekulāro mijiedarbību (šķērssaites nogrieznis iestatīts uz 3,5).Dažādu identitāšu domēni ir apzīmēti ar to krāsu32: MX1 domēns, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) un GED (569–660).OAS3 domēni: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) un OAS1_C (903-108).Domēns ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) un fn3 (777–864).STAT1 lauki: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) un STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Šķērssaistītu proteīnu (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 un STAT1) apļveida skatītājs ar mijiedarbību un mijiedarbību, kas apzīmētas attiecīgi zilā un sarkanā krāsā.Šķērssaišu slieksnis tika noteikts 3,5.Punktu diagrammas norāda STAT1 mijiedarbības vietas ar MX1 ​​(C), USP18 (D), ROBO1 (E) un OAS3 (F), kā arī K vai S mijiedarbības vietas starp diviem peptīdiem.Attēlā šķērssaites rezultāta slieksnis ir iestatīts uz 3,0.(G) dažādas mijiedarbības vietas starp STAT1 un OAS3 DI domēniem, kas uzliktas uz to olbaltumvielu struktūrām PyMol (PyMOL molekulārās grafikas sistēma, versija 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) un OAS3 (pdb id: 4s3n34).) programma.
Cilvēkiem ir aprakstītas divas USP18 izoformas, pilna garuma proteīns, kas pārsvarā atrodas kodolā, un izoforma bez N-termināla domēna USP18-sf, kas ir vienmērīgi sadalīta citoplazmā un kodolā36.Turklāt tika prognozēts, ka N-gals ir nestrukturēts, un tam nav nepieciešama izopeptidāzes aktivitāte vai ISG1537 saistīšanās.Lielākā daļa mūsu pētījumā konstatēto mijiedarbību atradās proteīna N-galā, kas liecina, ka šīs mijiedarbības ietver pilna garuma USP18 (4.A, D attēls) un tādējādi, iespējams, notiek kodolā.Turklāt mūsu dati arī norāda, ka N-gals ir specializēts olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbībai.IFNAR2 saistīšanās vieta atrodas starp 312.-368. atlikumiem, un, īpaši, neviens no kompleksā esošajiem proteīniem nesaistās ar šo reģionu (4.A attēls) 37,38.Šie dati kopā norāda, ka IFNAR2 saistošo domēnu izmanto tikai receptoru proteīns.Turklāt tika konstatēts, ka tikai OAS3 un ROBO1 ir saistīti ar domēniem augšpus N-gala un IFNAR2 saistīšanās vietas (4.A attēls).
ROBO1 pieder pie transmembrānu signalizācijas molekulu imūnglobulīnu (Ig) virsdzimtas un sastāv no pieciem Ig domēniem un trim fibronektīna (Fn) domēniem ekstracelulārajā reģionā.Šiem ārpusšūnu domēniem seko membrānas proksimālais reģions un viena transmembrānas spirāle 39. Nestrukturēts intracelulārs reģions atrodas C-galā un satur konservētus sekvences motīvus, kas mediē efektorolbaltumvielu saistīšanos39.Reģions, kas stiepjas no aminoskābēm ~ 1100 līdz 1600, lielākoties ir nesakārtots.Mēs noskaidrojām, ka MX1 mijiedarbojas ar ROBO1, izmantojot Ig, Fn un intracelulāros domēnus, savukārt lielākā daļa mijiedarbības ar STAT1 notiek starp tā CCD, linkera domēnu un ROBO1 C-galu (4.A, E att.).No otras puses, mijiedarbība ar DI, DIII un OAS3 linkera reģioniem tika izplatīta visā ROBO1 proteīnā (4. att.).
Oligoadenilāta sintāzes (OAS) proteīnu saime pieņem un saistās ar intracelulāro divpavedienu RNS (dsRNS), tiek pakļautas konformācijas izmaiņām un sintezē ar 2′,5′ saistītus oligoadenilātus (2-5 As) 40 .Tika konstatēts, ka no trim OAS OAS3 uzrāda vislielāko afinitāti pret dsRNS un sintezē vismazāko 2–5 As daudzumu, kas var aktivizēt RNāzi L un tādējādi ierobežot vīrusa replikāciju41.OAS saime sastāv no polimerāzes beta (pol-β) līdzīgiem nukleotīdu transferāzes domēniem.Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka C-gala domēna (DIII) katalītiskā aktivitāte ir atkarīga no dsRNS saistošā domēna (DI), kas nepieciešams OAS342 aktivizēšanai.Mēs novērojām, ka OAS3 DI un DII domēni mijiedarbojas ar CCD un nelielu savienojuma reģionu starp SH2 un STAT1 TAD (4.A, F attēls).Pārklājot dažādas šķērssaistīšanas vietas proteīna struktūrā, atklājās mijiedarbība starp β-loksni un DBD STAT1 cilpu un atvērtu kabatu vai dobumu, ko veido 60-75 atlikumi OAS3 DI domēnā (4. att. G).Proteīnu orientācija kompleksā arī norādīja, ka neviens no mijiedarbības ar OAS3 netraucēja tās DI domēna DNS saistošo spēju (S1 A att.).Turklāt GTPāzes MX1 N-terminālais domēns plaši mijiedarbojas ar OAS3 DI un DIII domēniem (4. att.).Mēs arī novērojām mijiedarbību starp OAS1 un MX1 visos trīs ar IFNα apstrādātajos atkārtojumos, kur viens OAS1 domēns (arī katalītiski aktīvs) mijiedarbojās ar visiem trim MX1 domēniem (S2A, B attēls).
MX proteīni ir daļa no lielas dyneīnam līdzīgu GTPāzes saimes, kas satur N-termināla GTPāzes domēnu, kas saista un hidrolizē GTP, starpdomēnu, kas ir starpnieks pašsavienošanās procesā, un C-termināla leicīna rāvējslēdzēju, kas darbojas kā GTPāze (LZ). ).domēna efektora domēns25,43.MX1 saistās ar vīrusu polimerāzes apakšvienībām, lai bloķētu vīrusa gēna transkripciju43.Iepriekš ziņotais rauga divu hibrīdu ekrāns parādīja, ka ar PIAS1 saistītais MX1 inhibē STAT1 mediētu gēnu aktivāciju, bloķējot DNS saistīšanās aktivitāti, kā arī tam ir SUMO E344,45 ligāzes aktivitāte.Šeit mēs parādām, ka MX1 saistās ar STAT1 (4.C, D attēls), tomēr tas, kā šī mijiedarbība ietekmē STAT1 mediēto gēnu aktivāciju, reaģējot uz IFNα, ir jāturpina pētīt.Turklāt mēs arī atklājām, ka MX1 mijiedarbojās ar IFIT3 un DDX60 visos trīs IFNα apstrādātajos atkārtojumos (S2C att.).
DDX60 ir IFN inducēta citoplazmas helikāze, par kuru iepriekš ziņots, ka tai ir nozīme no RIG-I neatkarīgā vīrusa RNS46 degradācijā.Tas mijiedarbojas ar RIG-I un aktivizē tā signalizāciju ligandam specifiskā veidā 46. DDX60 sastāv no DEXD/H-Box helikāzes domēna un C-termināla helikāzes domēna, kas saista vīrusa RNS un DNS47.Lielākā daļa tās mijiedarbības ar MX1 ​​un IFIT3 notiek garās N- un C-termināla reģionos bez kanoniskiem domēniem vai motīviem (S2E, F att.).Tomēr MX1 ​​ir saistīts arī ar DEXD/H-Box helikāzes domēnu (S2E att.).IFIT saimes olbaltumvielām ir atšķirīgas spirāles-pagrieziena-spirāles motīva tandēma kopijas, ko sauc par tetrapeptīda atkārtojumu (TPR).Tika konstatēts, ka IFIT3 ir pozitīvs RIG-I signalizācijas modulators un līdz ar to MAVS kompleksa sastāvdaļa.Kopumā mūsu dati liecina, ka IFIT3 un DDX60 mijiedarbojas galvenokārt reģionā starp IFIT3 TPR 3–6, un tiem var būt nozīme RIG-I/MAVS signalizācijā (S2F att.).
Ņemot vērā to, ka visa proteoma skrīnings ir skaitļošanas ziņā intensīvs, mēs pēc tam pārbaudījām visu cilvēka UniProt datu bāzi, lai noteiktu, vai tajā nav kāds no IFNα apstrādātajiem atkārtojumiem.Šajā replikā mēs atradām vairākus ļoti uzticamus HLA-A mijiedarbības tīklus.Tāpēc mēs koncentrējāmies uz MHC-I molekulu proteīnu mijiedarbības izpēti ar augstu ticamības pakāpi visos šķērssaistītajos paraugos.HLA sastāv no α1, α2 un α3 domēniem un vieglajām ķēdēm, un mikroglobulīns β2 (β2m) ir nemainīgs chaperona proteīns49.Kad HLA ir samontēts endoplazmatiskajā retikulumā, tas ir nestabils, ja nav peptīdu ligandu50.Peptīdu saistošo rievu veido ļoti polimorfs un nestrukturēts α1 un α2 domēns nepeptīdu formā un salīdzinoši mazāk polimorfs α351 domēns.
IFNα inducē HLA-A mijiedarbības tīklu ar H2B (H2BFS) un HMGA1.(A) 2D grafiks (ģenerēts SIM-XL programmatūrā), kas attēlo dažāda veida mijiedarbības H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksā: savstarpējā saite (zila), savstarpējā saite (sarkana) un viena saite (melna)..Dažādu identitāšu domēni ir apzīmēti ar krāsu kodiem32: H2B (histons; 2–102) un MHC-I (MHC_1; 25–203, grupa C1; 210–290 un MHC_I_C; 337–364).Šķērssaites slieksnis tika noteikts 3,5.Punktu diagrammas norāda HLA-A mijiedarbības vietas ar H2B (B) un HMGA1 (C), kā arī K vai S mijiedarbības vietas starp diviem peptīdiem.Attēlā šķērssavienojuma rādītāja slieksnis ir iestatīts uz 3,0.(D) Attiecības starp proteīniem, kas parādīti H2B, HLA-A un HMGA1 proteīnu struktūrās PyMOL programmā.Šīs struktūras tika modelētas, izmantojot Phyre2 serveri (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), un veidņu struktūras H2B, HLA-A un HMGA1 proteīniem bija attiecīgi 1kx552, 1kj349 un 2eze55.
IFNα inducē HLA-A mijiedarbības tīklu ar H2B (H2BFS), MDN1 un LRCH4.(A) Intramolekulāras (sarkanas) un starpmolekulāras (zilas) šķērssaites, kas parādītas 2D interaktīvā kartē (ģenerēta SIM-XL programmatūrā) ar MDN1, kas attēlots kā aplis.Šķērssaites slieksnis tika noteikts 3,5.Dažādu identitāšu domēni ir apzīmēti ar krāsu kodiem32: H2B (histons; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupa C1; 210–290 un MHC_I_C; 337–364) un LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) un CH (535–641)).(B) Attiecības starp proteīniem, kas PyMOL programmā parādīti H2B, HLA-A, LRCH4 un MDN1 proteīnu struktūrās.Šīs struktūras tika modelētas, izmantojot Phyre2 serveri (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ar veidņu struktūrām 1kx552, 1kj349, 6hlu62 un 6i2665 H2B, HLA-A, LRCH4 un MDN1 proteīniem, attiecīgi.Punktu diagrammas, kas parāda K vai S mijiedarbības vietas HLA-A ar H2B (C), LRCH4 (D) un MDN1 (E).Parauglaukumiem šķērssaites rezultāta slieksnis tika iestatīts uz 3,0.
Papildus genoma integritātes saglabāšanai histons H2B ir iesaistīts arī transkripcijas regulēšanā.H2B proteīns sastāv no centrālā histona domēna (HFD), ko veido trīs α-spirāles, kas atdalītas ar cilpām, un C-gala aste 41,52.Lielākā daļa mijiedarbības ar H2B notiek α1 spirālē, kas nodrošina trimerizāciju ar HFD heterodimēru (5A, B att.).Lai gan lizīni ir iesaistīti DNS saistīšanā, daži lizīni ir arī alternatīvas acetilēšanas vai metilēšanas vietas.Piemēram, H2B atlikumi K43, K46 un K57 nav iesaistīti tiešā DNS saistīšanā, bet ir dažādu pēctranskripcijas modifikāciju mērķi53.Līdzīgi atlikumiem K44, K47 un K57 H2B var būt alternatīva loma IFNα klātbūtnē, tostarp mijiedarbībā ar citiem proteīniem (5.A, B att.).Turklāt ekstrahromosomu histons H2B aktivizē imūnreakciju dažādos šūnu veidos, darbojoties kā citozola sensors, lai noteiktu divpavedienu DNS (dsDNS) fragmentus, kas iegūti no infekcijas izraisītājiem vai bojātām šūnām54.DNS vīrusu klātbūtnē H2B samazināšanās kavēja IFN-β ražošanu un STAT154 fosforilēšanos.Ir arī zināms, ka H2B pārvietojas kodolā un no tā ātrāk nekā citi serdes histoni54.Atsevišķos neapstrādātos paraugos tika novērota arī H2B mijiedarbība ar MDN1 un LRCH4.Mēs noskaidrojām, ka HLA-A mijiedarbojās ar H2B visos trīs ar IFNα apstrādātajos paraugos un vienā neapstrādātā atkārtotā paraugā.Šie dati atspoguļo H2B lomu alternatīvā fizioloģiskā funkcijā, kas nav atkarīga no transkripcijas regulējuma.
HMGA1 (augstas mobilitātes grupa AT-Hook 1), neliels nukleoproteīns, kas bagāts ar slimību veicinošām aminoskābēm, ir identificēts saistībā ar HLA-A.Tam ir skāba C-gala aste un trīs atšķirīgi DBD, ko sauc par AT āķiem, jo ​​tie saistās ar AT bagātā reģiona mazāko rievu dsDNS55,56.Šī saistīšanās liek DNS saliekties vai iztaisnot, ļaujot kanoniskajiem transkripcijas faktoriem piekļūt tās konsensa secībai.Tiek uzskatīts, ka C-gala aste ir iesaistīta olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbībā un transkripcijas faktoru piesaistē, jo C-gala dzēšanas mutanti nespēj uzsākt transkripciju57.Turklāt šajā domēnā ir vairākas konservētas fosforilācijas vietas, kas ir zināmi kināžu substrāti 58 .Mēs novērojām HLA-A un H2B mijiedarbību ar HMGA1 ārpus C-termināla domēna, kas liecina, ka C-terminālais domēns galvenokārt tiek izmantots transkripcijas faktora saistīšanai (5.A, C att.).HMGA olbaltumvielas konkurē ar histonu H1 par saistīšanos ar adaptera DNS, tādējādi palielinot piekļuvi57.Līdzīgi šķiet, ka HMGA mijiedarbojas ar histonu H2B gar linkera DNS, konkurējot ar histonu H1.HMGB1 inducē HLA-A, -B un -C ekspresiju dendrītu šūnās, izraisot to aktivāciju59, taču iepriekš nav ziņots par HMG un HLA mijiedarbību.Mēs noskaidrojām, ka HMGA1 mijiedarbojas ar HLA-A α1 un α3 domēniem ar lielāko daļu mijiedarbību ārpus tā 3 dBD (5.a, c attēls).Mūsu rokās tika konstatēts, ka HLA-A ir lokalizēts kodolā (dati nav parādīti), un, ņemot vērā, ka H2B un HMGA1 atrodas arī kodolā, šī mijiedarbība, iespējams, notiek kodolā.Specifiski addukti, kas mērīti starp H2B, HLA-A un HMGA1, ir parādīti 5.D attēlā.
Lielākā daļa HLA-A mijiedarbības ar citiem proteīniem notiek tās α1 un α2 domēnos un nesakārtotajā C-termināla domēnā (6. attēls).Vienā no šiem piemēriem mēs atklājām, ka HLA-A mijiedarbojas ar LRCH4 nesakārtoto N-gala asti (6.A, D attēls).LRCH4 regulē TLR4 aktivāciju un LPS citokīnu indukciju, tādējādi modulējot iedzimto imūnreakciju 60, 61.Tas ir membrānas proteīns ar deviņiem ar leicīnu bagātiem atkārtojumiem (LRR) un kalmodulīna (CH) homoloģijas motīvu ektodomēnā, kam seko transmembrānas domēns (TMD) 60 , 62 .Ir ziņots, ka CH domēni veicina proteīnu un olbaltumvielu mijiedarbību60.Apmēram 300 aminoskābju posms starp LRR un CH domēniem ir salīdzinoši pieejams, bet nesakārtots.Mijiedarbība ar MDN1 tika izplatīta visā proteīna garumā, ieskaitot LRR1, LRR6, CH domēnus un nejaušos reģionus, savukārt H2B galvenokārt saistās ar CH domēnu (6.A, B att.).Proti, neviena no mijiedarbībām neietvēra TMJ, kas liecina par CLMS pieejas specifiku (6.A, B attēls).
MDN1 ir arī identificēts kā daļa no HLA-A proteīnu tīkla (6.A attēls).Tas pieder pie AAA olbaltumvielu saimes (ATPāzes, kas saistītas ar dažādām aktivitātēm).Šis ir tas pats N-termināla AAA domēns, kas organizējas heksamēriskā gredzenā un noņem montāžas faktoru no 60S 64 ribosomu apakšvienības.šķiet līdzīgs dynein64, 65, 66.Turklāt Asp/Glu bagātajam reģionam seko MIDAS domēns (no metāla jonu atkarīga vieta).Sakarā ar MDN1 lielo izmēru (aptuveni 5600 aminoskābes) un tā ierobežoto homoloģiju ar labi pētītajiem proteīniem, maz ir zināms par tā struktūru un funkcijām cilvēkiem.Mēs identificējām HLA-A, H2B un LRCH4 kā MDN1 saistošos partnerus un atklājām to orientāciju kā proteīnu kompleksus PyMol (6.A un B att.).Šie trīs proteīni mijiedarbojas ar AAA domēnu, dyneīnam līdzīgo linkera domēnu un, iespējams, MIDAS MDN1 domēnu.Iepriekšējā ziņojumā ēsmas proteīnu afinitātes attīrīšana identificēja MDN1 kā proteīnu, kas saistīts ar histonu H2B67.Šī kompleksa identificēšana ar IFNα apstrādātajos paraugos liecina par MDN1 lomu interferona signalizācijā.
Tā kā HLA gēni ir ļoti polimorfiski, mēs ekstrahējām sekvencēšanas nolasījumus, kas kartē HLA-A, -B un -C no Flo-1 šūnu RNS sekvencēšanas datiem (dati nav parādīti).Peptīdu sekvences, kas atbilst sekvencēšanas nolasījumam, atklāja būtiskas atšķirības starp HLA-A, -B un -C reģionos, kur HLA-A atradās šķērssaistīti peptīdi (S3. attēls).Turklāt mēs nenovērojām HLA-B/C molekulu savstarpējo saikni starp proteīniem ar H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 proteīniem.Tas liek domāt, ka proteīnu mijiedarbība starp HLA-A, MDN1, LRCH1 un HMGA1 ir specifiska HLA-A.Turklāt nesaistītu paraugu proteomiskā analīze (S4 tabula) parādīja, ka HLA-A ir lielāks sekvences pārklājums, salīdzinot ar HLA-B vai HLA-C.HLA-A identificētie peptīdi bija augstas intensitātes gan ar IFNα apstrādātos, gan neapstrādātos paraugos.
Lai nodrošinātu, ka šeit identificētās mijiedarbības nav saistītas ar divu proteīnu nespecifisku šķērssavienojumu tiešā telpiskā tuvumā, mēs papildus apstiprinājām divus jaunus HLA-A mijiedarbības faktorus, veicot līdzimunoprecipitācijas testus.HLA-A mijiedarbība ar endogēno MDN1 un H2B tika konstatēta gan ar IFNα apstrādātās, gan neapstrādātās Flo-1 šūnās (7. attēls, S4 attēls).Mēs apstiprinājām, ka H2B imūnprecipitātos tvēra HLA-A un ka šī saistība bija saistīta ar IFNα ārstēšanu, jo HLA-A nebija imūnprecipitāta paraugos no neapstrādātām šūnām (7.A attēls).Tomēr mūsu dati liecina, ka IFNα atšķirīgi regulē HLA-A saistīšanos ar H2B un MDN1.IFNα izraisa saistību starp H2B un HLA-A, bet samazina tās saistību ar MDN1.Mēs noskaidrojām, ka MDN1 bija saistīts ar HLA-A kontrolēs, un IFNα pievienošana samazināja šo mijiedarbību neatkarīgi no MDN1 indukcijas ar IFNα (7.B, C attēls).Turklāt HLA-A imunoprecipitācija notverti H2B A549 šūnās (S4 att.), kas liecina, ka šī mijiedarbība nav atkarīga no šūnu veida.Kopumā šie rezultāti atbalsta interferona mediētu HLA-A mijiedarbību ar H2B un MDN1.
HLA-A kopīgi attīra H2B un MDN1.Reprezentatīvie endogēnie H2B (A) un MDN1 (B) imūnbloti tika imunizēti nogulsnēti no IFNα apstrādātām Flo-1 šūnām un pārbaudītas norādītajām antivielām.Peles un truša IgG tika izmantota kā negatīva kontrole.(C) Dažādu antigēnu relatīvais daudzums (ievade) ir attēlots ar imūnblotiem, kas pārbaudīti pret norādītajām antivielām, β-aktīns tika izmantots kā slodzes kontrole.
Tika izpētītas viena no interferona izraisītajiem ļoti uzticamajiem, savstarpējiem savienotajiem tīkliem H2B-HLA-A-HMGA1 strukturālās īpašības.Mēs izmantojām molekulārās dinamikas modelēšanu kā alternatīvu pieeju, lai izprastu šajā kompleksā iesaistīto proteīnu konformācijas dinamiku (8. attēls).Secinājumi no CLMS datiem liecina par dažādu H2B, HLA-A un HMGA1 proteīnu konformāciju iespējamību.Tāpēc šķīdinātāja vidē tika modelēti šādi potenciālie kompleksi: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A un H2B-HLA-A-HMGA1.Sākotnējais proteīna-olbaltumvielu dokstacijas ekrāns, izmantojot MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Monreāla, Kvebeka, Kanāda) pakotni, liecināja par iespējamām konformācijām, kas atšķiras starp šiem proteīniem (8.A attēls).Docking proteīna kompleksa vizualizācija atklāja vairākas mijiedarbības un iespējamās konformācijas (5.A, 8. attēls).Tādējādi viena iespējamā konformācija ir parādīta 8.a attēlā (ar marķētām krusteniskām saitēm), un to tālāk novērtēja, izmantojot MD modelēšanas cauruļvadu.Turklāt H2B vai HMGA1 saistīšanās ar HLA-A izceļ H2B augstāku afinitāti pret HLA-A (8.A attēls).
Iespējamo tīklu konformācijas dinamika starp H2B (H2BF) -HLA-A, HMGA1-HLA-A un H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksiem.(A) Kreisais panelis ir intramolekulāro (sarkano) un starpmolekulāro (zilu) šķērssaišu 2D karte (ģenerēta SIM-XL programmatūrā) (šķērssaites robežvērtība iestatīta uz 3,5).Turklāt identificētie šķērssaistošie atlikumi ir marķēti uz H2B, HLA-A un HMGA1 proteīnu struktūrām.Šo proteīnu saistītās konformācijas tika ekstrahētas, izmantojot dokstacijas cauruļvadu, kas ieviests MOE pakotnē.Apakšējā kreisajā panelī ir redzamas dažādas iespējamās H2B-HLA-A un HMGA1-HLA-A kompleksu konformācijas ar atšķirīgu proteīnu-olbaltumvielu saistīšanās afinitāti (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Atomu pozīciju (izņemot ūdeņraža atomus) standarta novirze (RMSD) katrai proteīna struktūrai.(C) Starpmolekulārā proteīna-olbaltumvielu ūdeņraža saites mijiedarbība no dažādiem simulētiem kompleksiem, ņemot vērā specifiskās mijiedarbības, kuru ilgums ir ≥ 10 ns.H-saites donora-akceptora nogriešanas attālums tika iestatīts uz 3,5 Å, un donora-H-akceptora nogriešanas leņķis tika iestatīts uz ≥ 160 °–180 °.(D) Marķēti atlikumi, kas veido HLA-A proteīna-olbaltumvielu mijiedarbību ar attiecīgajiem partneriem, aptverot ≥ 20 ns, kas iegūti no fiktīviem HLA-A-H2B un HLA-A-HMGA1 kompleksiem.Olbaltumvielu struktūras atspoguļo vidējo 100 ns MDS struktūru.(E) Mijiedarbība starp HLA-A-H2B un HLA-A-HMGA1 kompleksiem, salīdzinot ar mijiedarbību, kas izsekota ar H2B-HLA simulāciju 100 ns, pamatojoties uz K vai S mijiedarbības vietu starp diviem peptīdiem.Kompleksi /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Šķērssaišu novērtēšanas sliekšņa vērtība tika iestatīta uz 3,0, un tika ņemta vērā specifiskā mijiedarbība no MDS, kas ≥ 10 ns.Olbaltumvielu struktūras tika vizualizētas, izmantojot BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., Sandjego, CA, ASV) un Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Monreāla, Kvebeka, Kanāda) pakotnes.
HLA-A molekulu stabilitāte laika gaitā (standarta novirze; RMSD vai standarta novirze; RMSF) norādīja, ka H2B vai HMGA1 proteīnu klātbūtne kompleksos stabilizēja HLA-A (8.B attēls, S5 attēls).HMGA1 proteīns cieši saistās ar HLA-A B2M vietu, izraisot HLA-A aminoskābju stabilitāti HLA-A-HMGA1 vai H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksā (8.B attēls, S5 attēls).jo īpaši tika konstatēts, ka HLA atlikumi ~60-90 un ~180-210 ir mazāk elastīgi H2B klātbūtnē (8.B att.).H2B un HMGA1 uzrādīja labāku saistīšanos ar HLA-A H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksā, salīdzinot ar HLA-A saistīšanos tikai ar H2B vai HMGA1 (8.C un D attēls; S5 tabula).Uzticamība (8E att.).
Olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbība veido dinamiskus strukturālus tīklus, kas veic intracelulāro komunikāciju, reaģējot uz noteiktiem stimuliem.Tā kā daudzas proteomikas pieejas nosaka izmaiņas proteīna vispārējā līdzsvara stāvokļa līmenī, olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbības dinamikai ir nepieciešami papildu rīki, lai uztvertu saistošās saskarnes, un CLMS ir viens no šādiem instrumentiem.Interferona signalizācijas sistēma ir citokīnu tīkls, kas ļauj šūnām reaģēt uz dažādiem vides patogēniem un iekšējiem patoloģiskiem signāliem, kas beidzas ar interferona inducējamo proteīnu apakškopu indukciju.Mēs izmantojām CLMS, lai noteiktu, vai interferona izraisītu proteīnu panelī var identificēt jaunas olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbības.Olbaltumvielu kompleksu uztveršanai tika izmantota globālā proteīnu šķērssaistīšanas analīze interferonu reaģējošā Flo-1 šūnu modelī.Triptisko peptīdu ekstrakcija no nesaistītām un šķērssaistītām šūnām ļauj veikt peptīdu skaitīšanu, ceļu bagātināšanu un peptīdu garuma sadalījumu ar noteiktu LFQ intensitāti.Kanoniskās interferonu inducējamās olbaltumvielas tika identificētas kā pozitīva iekšējā kontrole, savukārt tika novēroti jauni starpmolekulārie un intramolekulārie šķērssaistīti kanonisko interferonu inducējamo proteīnu addukti, piemēram, MX1, UP18, OAS3 un STAT1.Ir izpētītas dažādas strukturālās iezīmes un mijiedarbības funkcionālajās zonās.
Mijiedarbība starp HLA-A, MDN1 un H2B tika atklāta ar imūnblotēšanu Flo-1 un A549 šūnās, kas apstrādātas un neapstrādātas ar IFNα.Mūsu rezultāti liecina, ka HLA-A kompleksē ar H2B no IFNα atkarīgā veidā.Mūsu darbs ir interesants ceļš, lai turpinātu izpētīt šo divu kompleksu līdzās lokalizāciju.Būtu arī interesanti paplašināt CLMS pieeju šūnu līniju panelim, lai identificētu no šūnu tipa neatkarīgu interferona mediētu proteīnu mijiedarbību.Visbeidzot, mēs izmantojām MD modelēšanu kā alternatīvu pieeju, lai izprastu H2BFS-HLA-A-HMGA1 kompleksā iesaistīto proteīnu konformācijas dinamiku, kas izsekoja intramolekulāras un starpmolekulāras savstarpējas sarunas.Secinājumi no CLMS datiem liecina par dažādu H2BFS, HLA-A un HMGA1 proteīnu konformāciju iespējamību.Iespējamās atšķirīgās konformācijas starp šiem dokstacijas proteīnu kompleksiem atklāja vairākas mijiedarbības, kas līdzīgas tām, kas novērotas CLMS datu kopā.Viena no mūsu metodes galvenajām priekšrocībām ir tā, ka tā ļauj viegli identificēt mijiedarbīgus ļoti polimorfus gēnus, piemēram, HLA, tāpēc būs interesanti pētīt HLA haplotipam raksturīgo proteīnu mijiedarbību, kuras citādi ir grūti izpētīt.Kopumā mūsu dati parāda, ka CLMS var izmantot, lai paplašinātu mūsu izpratni par interferona izraisītiem signalizācijas tīkliem un nodrošinātu pamatu sarežģītāku starpšūnu sistēmu izpētei audzēja mikrovidē.
Flo-1 šūnas tika iegūtas no ATCC un uzturētas DMEM (Gibco), kas papildināts ar 1% penicilīnu/streptomicīnu (Invitrogen), 10% liellopu augļa serumu (Gibco) un uzglabātas 37 °C un 5% CO2.Inkubācija.Šūnas tika audzētas līdz 70–80% saplūšanai, pirms tās tika apstrādātas ar IFNα14 (ražo Edinburgas proteīnu ražošanas uzņēmums).Visas pārējās ķīmiskās vielas un reaģenti tika iegādāti no Sigma Aldrich, ja vien nav norādīts citādi.
Flo-1 šūnas tika kultivētas 6 bedrīšu plāksnēs, un nākamajā dienā šūnas tika apstrādātas ar 10 ng/ml IFNα14 24 stundas līdz aptuveni 80% saplūšanai.Šūnas trīs reizes mazgāja ar PBS un ligēja ar svaigi sagatavotu DSS (Thermo Fisher Scientific) (izšķīdinātu DMSO) PBS 5 minūtes 37 ° C temperatūrā līdz galīgajai koncentrācijai 0, 5 mM.DSS šķērssaistīšanas reakcija tika aizstāta ar PBS, un atlikušais DSS tika dzēsts, pievienojot 20 mM Tris (pH 8, 0) PBS 15 minūtes 37 ° C temperatūrā.Šūnas tika savāktas, nokasot, un savāktas mēģenēs ar zemu saistīšanu (Axygen).
Visas centrifugēšanas darbības tika veiktas ar ātrumu 14 000 xg 8 ° C temperatūrā.Centrifugējiet lizātu 10 minūtes un pārnesiet supernatantu uz jaunu mēģeni.Atlikušās skaidrās daļiņas tika izšķīdinātas 150 μl otrā līzes buferšķīduma (2 M urīnviela, 2% (w/v) SDS (nātrija dodecilsulfāts)) 30 minūtes vai ilgāk, līdz tika iegūts viendabīgs ūdens šķīdums.Lizāts tika centrifugēts 20 minūtes, un supernatants tika sajaukts ar iepriekšējā solī iegūto lizātu.Olbaltumvielu koncentrācijas tika novērtētas, izmantojot Micro BCA testu (Thermo Fisher Scientific) saskaņā ar ražotāja norādījumiem par mikroplates procedūrām.Paraugi tika ātri sasaldēti šķidrā slāpeklī un uzglabāti -80 ° C temperatūrā.
Aptuveni 100 μg šķīstošā šķērssaistītā proteīna tika apstrādāti, izmantojot modificētu filtrēšanas parauga sagatavošanas protokolu (FASP), kā aprakstījis Wisniewski et al.69 Īsumā, olbaltumvielas tiek šķērssavienotas ar 200 µl urīnvielas buferšķīduma (8 M urīnviela 0,1 M Tris, pH 8,5), maisa un pārvērš uz pusi.Visas centrifugēšanas darbības tika veiktas ar ātrumu 14 000 xg 25 ° C temperatūrā.Pirmā puse no šķērssaistītā proteīna lizāta tika pārnesta uz 10 kDa Microcon centrbēdzes filtra ierīci, kas aprīkota ar Ultracel-10 membrānu (Merck), kam sekoja centrifugēšana uz filtra 25 minūtes.Pēc tam pievienojiet filtram otro proteīna pusi un atkārtojiet tās pašas darbības.Olbaltumvielu atgūšana tika veikta, pievienojot 100 μl 17 mM tris(2-karboksietil)fosfīna hidrohlorīda (TCEP) urīnvielas buferšķīdumā.Atgūšana tika maisīta termomikserā ar ātrumu 600 apgr./min 30 minūtes 37 °C temperatūrā.Turklāt kolonnu centrifugēja un reducēto šķērssaistīto proteīnu alkilēja, izmantojot 100 μl 50 mM jodacetamīda urīnvielas buferšķīdumā.Alkilēšanas reakcija tika veikta istabas temperatūrā 20 minūtes tumsā.Pagrieziet kolonnu, mazgājiet kolonnas sienas 3 reizes ar 100 µl urīnvielas buferšķīduma un pēc tam centrifugējiet.Tāda pati operācija tika veikta 3 reizes, izmantojot 100 μL 100 mM amonija bikarbonāta.Pirms tripsinizācijas nomainiet savākšanas cauruli ar jaunu.Pievienojiet gremošanas buferšķīdumu, kas satur 50 mM amonija bikarbonātu un 1 µL tripsīnu, kas atšķaidīts tripsīna buferšķīdumā (Promega).Trypsīna un olbaltumvielu attiecība tika uzturēta aptuveni 1:33, un gremošanas reakcijas inkubēja nakti 37 ° C temperatūrā mitrā kamerā.Krustotais peptīds tika eluēts no filtra ar centrifugēšanu 25 minūtes.Peptīdu atgūšana tika uzlabota, pievienojot filtram 50 μl 0, 5 M NaCl, kam sekoja centrifugēšana 25 minūtes.
Īsumā, C18 centrifūgas kolonnas tika aktivizētas, trīs reizes mazgājot 0,1% skudrskābi (FA) acetonitrilā (AcN) (Merck) un divas reizes mazgājot ar 0,1% FA.Kolonna tika hidratēta ar 0, 1% FA 15 minūtes.Ievietojiet paraugus centrifūgas kolonnās un 3 reizes mazgājiet ar 0,1% FA.Atsālītie peptīdi tika secīgi eluēti ar pakāpenisku gradientu, izmantojot 50%, 80% un 100% AcN 0, 1% FA.Paraugus žāvēja SpeedVac Plus koncentratorā (Eppendorf), līdz pilnībā izzuda atlikušais šķidrums.Eluētie peptīdi tika izšķīdināti 100 μl 0,08% trifluoretiķskābes 2,5% AcN un koncentrācijas tika mērītas ar NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).LC-MS/MS sistēmā tika ievadīts aptuveni 1 μg šķērssaistīta peptīda katrā paraugā.
Šķērssaistītie peptīdi tika savākti uz 300 µm ID, 5 mm garas µ-pirmskolonnas C18 uztveršanas kolonnas, kas pildīta ar C18 PepMap100 sorbentu un 5 µm PepMap sorbentu (Thermo Scientific).Ievietojiet sūkņa plūsmas komplektu ar ātrumu 5 µl/min 0,08% trifluoretiķskābes, kas izšķīdināta 2,5% AcN.Kustīgās fāzes A un B sastāvēja attiecīgi no 0,1% FA ūdenī un 0,1% FA acetonitrilā.Gradients sākas ar 2,5% B un lineāri palielinās līdz 40% B 90 minūšu laikā, pēc tam līdz 90% B nākamo 2 minūšu laikā.Kustīgās fāzes sastāvs tika uzturēts 90% B 10 minūtes un pēc tam lineāri samazinājās līdz 2, 5% B 2 minūšu laikā.Kolonna tika līdzsvarota pie 2,5% B 8 minūtes pirms nākamā cikla.
Orbitrap Exploris 480 masas spektrometrs darbojās pozitīvā datu korelācijas režīmā.Pilna skenēšana tika veikta sekcijas režīmā ar izšķirtspēju 120 000 ar diapazona iestatījumiem no m/z 350 Th līdz m/z 2000 Th.Normalizētais AGC mērķis tika iestatīts uz 300% ar maksimālo ievades laiku 50 ms.Peptīdiem ir noteikta monoizotopiskā pīķa noteikšana.Ierobežojuma relaksācijas parametrs tiek iestatīts uz patiesu, ja tiek atrasts pārāk maz prekursoru.Prekursora minimālā jonu stiprums tika iestatīts uz 5, 0e3, un eksperimentos tika iekļauti prekursora lādiņa stāvokļi līdz +8.
Cikla laiks starp galvenajiem skenējumiem datu korelācijas režīmā tika iestatīts uz 2,5 sekundēm.Dinamiskā masas izslēgšana tika iestatīta uz 20 s pēc pirmās prekursora jonu sadrumstalotības.Prekursora izolācijas logs tika iestatīts uz 2 Th.Normalizētās sadursmes enerģijas veids ar fiksētu sadursmes enerģijas režīmu tika izvēlēts no datiem atkarīgā MS/MS skenēšanā.Sadursmes enerģija iestatīta uz 30%.Orbitrap izšķirtspēja tika iestatīta uz 15 000 un AGC mērķis ir 100%.Pielāgotais maksimālais injekcijas laiks ir iestatīts uz 60 milisekundēm.
Pirms proteīna-olbaltumvielu tīkla izsekošanas šķērssaistītajos paraugos mēs apstrādājām neapstrādātos failus, izmantojot MaxQuant pakotni (versija 1.6.12.0)26,27, lai paraugos identificētu izsekojamos peptīdus/olbaltumvielas.Turklāt līdzīgas proteomiskās analīzes tika veiktas nesaistītiem Flo-1 paraugiem, kas apstrādāti un neapstrādāti ar IFNα.Meklēšana tika veikta, nenorādot fermenta specifiku un dažādas deamidācijas (N, Q) un oksidācijas (M) modifikācijas.Prekursoru masas pielaides tika iestatītas uz 20 ppm un produkta jonu pie 0, 02 Da.Sākotnējā un maksimālā masas novirze tika iestatīta uz 10 ppm.Peptīda maksimālā masa tika iestatīta uz 4600 Da, un secības līdzība tika iestatīta no 7 līdz 25 aminoskābēm (aa).Papildu statistiskā analīze tika veikta, izmantojot programmu Perseus (versija 1.6.10.45).Olbaltumvielu saturs tika aprēķināts, normalizējot proteīna spektrālo intensitāti (LFQ intensitāte; nemarķēta kvantifikācija)27, un intensitātes vērtības tika pārveidotas par Log2.Hierarhiska proteīnu klasterizācija, kas identificēta pēc to peptīdu intensitātes, tika izveidota, izmantojot pheatmap (v1.0.12) pakotni R (v 4.1.2).Ceļa bagātināšanas analīze tika veikta, izmantojot Reactome ceļa datubāzi ar IFNα apstrādātiem proteīniem, kas tika aktivizēti vairāk nekā četras reizes, salīdzinot ar neapstrādātiem paraugiem.
Proteīna kompleksu lizīnam (K) vai serīnam (S) specifisko ķīmisko šķērssavienojumu identificēšana, ko uzrauga LC-MS/MS, tika veikta, izmantojot spektroskopisko identifikācijas iekārtu (SIM-XL) šķērssaistītiem peptīdiem (SIM-XL)29.Pirmkārt, tika pētīta iespējamā mijiedarbība starp ar interferonu saistīto (IFN) DNS bojājumu rezistences paraksta (IRDS) gēniem, izmantojot IRDS proteīnu datu kopu, kas aprakstīta Padariya et al.28.Visu cilvēka UniProt apstākļu un atkārtojumu skrīnings ir skaitļošanas ziņā intensīvs, tāpēc visa cilvēka UniProt datubāze (www.uniprot.org) (lejupielādēta 2020. gada 12. augustā, satur 75 093 ierakstus) pret ar IFNα apstrādātiem atkārtojumiem.Viens no filtriem augstai uzticamībai.Šīs iegūtās augstas nozīmes mijiedarbības tika paplašinātas un pārbaudītas visos atkārtojumos un apstākļos.
SIM-XL versijā šķērssavienojumam (XL) tika izmantots DSS, un XL svara maiņa un modifikācijas svara maiņa tika iestatīta attiecīgi uz 138,06 un 156,07.Tiek ņemtas vērā šādas šķērssaistīšanas reakcijas vietas: KK, KS un KN-TERM, bez reportierjoniem.Gan prekursora, gan fragmenta ppm tika iestatīts uz 20, un Xrea slieksnis tika iestatīts uz 0,15.Tripsīns tika uzskatīts par pilnīgi specifisku, un tika ieviesta augstas enerģijas C-slazdu (HCD) sadrumstalotības metode.XCorr dinamiskās DB samazināšanas slieksnis un minimālais peptīdu skaits dinamiskai DB samazināšanai tika iestatīts attiecīgi uz 2,5 un 2.Citi parametri ir: monoizotopu varbūtība un maksimālās sakritības robežvērtība, vismaz 4 AA atlikumi vienā virknē un maksimālais virknes lādiņš un 3 maksimumi nokavēto sadalījumu.Iegūtās sašūtās ​​2D kartes tika analizētas (SIM-XL), un 2D karšu izveidošanai tika izmantots xQuest28 grafiskais attēlojums.Olbaltumvielu savienojumi uz olbaltumvielu struktūrām ir sniegti Pymol (Pymol Molecular Graphics System, versija 2.0 Schrödinger, LLC).
Phyre2 ģenerē modeļa struktūras, pamatojoties uz secību saskaņošanu ar zināmām olbaltumvielu struktūrām.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 un MDN1 proteīniem tika izmantotas veidņu struktūras 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 un 6i2665.Turklāt tika ņemta vērā arī AlphaFold71 MX1, UBP18 un ROBO1 struktūra.