ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dupleksa metināta caurule ķīmiskās rūpniecības ķīmiskajai sastāvdaļai, SPECC1L deficīts palielina savienoto savienojumu stabilitāti un samazina galvaskausa nervu kores šūnu izkliedi.

Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Turklāt, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs rādām vietni bez stiliem un JavaScript.

ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 dupleksa metināta caurule ķīmiskajai rūpniecībai

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ir vadošais ražotājs , kas specializējas nerūsējošā tērauda bezšuvju caurulēs , spilgti atkvēlinātās caurulēs , bezšuvju tinumu caurulēs utt .Lai atvieglotu klientus, esam arī metinājuši caurules un caurules.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ir vismodernākās ražošanas un testēšanas iekārtas.Mēs varam pilnībā apmierināt jūsu prasību.Saskaņā ar standartu ļoti stingri, mūsu ražotajām caurulēm vienmēr ir pareiza OD un WT pielaide.Pielaides kontrole ir stingri saskaņā ar ražošanas standartiem.Mūsu produkti vienmēr ir apmierināti ar klientiem.Klienti, kas iegādājās mūsu produktus, radīja lielāku peļņu.
a) OD (ārējais diametrs): no 3,18 mm līdz 101,6 mm
b) WT (sienas biezums): 0,5–20 mm
c) garums: atbilstoši klienta prasībām
d) Standarti: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 utt
e) Apstrādes metode: ERW, EFW utt

Slīdņi, kas parāda trīs rakstus katrā slaidā.Izmantojiet pogas Atpakaļ un Nākamais, lai pārvietotos pa slaidiem, vai slaidu kontrollera pogas beigās, lai pārvietotos pa katru slaidu.
Galvaskausa nervu cekulas šūnas (CNCC) atdalās no embriju nervu krokām un migrē uz rīkles arkām, kas veido lielāko daļu vidusdaļas struktūru.CNCC disfunkcijai ir svarīga loma orofaciālās plaisas etioloģijā, kas ir izplatīta iedzimta malformācija.Pacientiem ar netipiskām un sindromiskām plaisām ir konstatētas heterozigotas SPECC1L mutācijas.Šeit mēs ziņojam par pastiprinātu kanoniskās adhezīvās savienojuma (AJ) komponentu, β-katenīna un E-kadherīna krāsošanu kultivētās SPECC1L notriekšanas šūnās, un elektronu mikrogrāfijās ir redzama AJ apikālā-bazālā difūzija.Lai saprastu SPECC1L lomu galvaskausa un sejas morfoģenēzē, mēs izveidojām Specc1l deficīta peles modeli.Homozigoti mutanti ir embrionāli letāli, un tiem ir traucēta nervu caurules slēgšana un CNCC laminēšana.AJ proteīna krāsošana ir palielināta mutantu nervu krokās.Šis AJ defekts atbilst CNCC atslāņošanās defektam, kam nepieciešama AJ izšķīdināšana.Turklāt Specc11 mutanti ir samazinājuši PI3K-AKT signālu pārraidi un palielinājuši apoptozi.In vitro viegla PI3K-AKT signālu inhibīcija savvaļas tipa šūnās bija pietiekama, lai izraisītu AJ izmaiņas.Svarīgi, ka SPECC1L notriekšanas izraisītās AJ izmaiņas var mainīt, aktivizējot PI3K-AKT ceļu.Kopumā šie dati liecina, ka SPECC1L kā jauns PI3K-AKT signalizācijas un AJ bioloģijas regulators ir nepieciešams nervu caurules slēgšanai un CNCC stratifikācijai.
Galvaskausa nervu ceku šūnas (CNCC) lokalizējas muguras neiroektodermā un atdalās no attīstošo nervu kroku neiroepitēlija, izmantojot procesu, kas ietver epitēlija-mezenhimālo pāreju (EMT) 1, 2, 3.Premigrējošie epitēlija CNCC izjauc starpšūnu savienojumus un kļūst par migrējošiem mezenhimāliem CNCC, kas aizpilda pirmo un otro rīkles arku un veido lielāko daļu galvaskausa un sejas skrimšļa.Tādējādi gēni, kas regulē CNCC funkciju, bieži tiek traucēti galvaskausa un sejas iedzimtu anomāliju, piemēram, orofaciālo plaisu, etioloģijā, kas visbiežāk skar 1/800 dzemdību tikai ASV.Viena no iedzimtajām deformācijām8.
CNCC atslāņošanās sakrīt ar priekšējās nervu caurules slēgšanu no 8, 5 līdz 9, 5 dienām pēc embrionālās attīstības pelēm.Vairāku ar mutes un sejas plaisu saistītu gēnu mutantiem ir arī daži nervu caurules defekti, tostarp Irf69, 10, Ghrl310, Cfl111 un Pdgfrα12.Tomēr nervu caurules slēgšanas un CNCC stratifikācijas procesus var uzskatīt par neatkarīgiem, jo ​​Splotch mutantu pelei (Pax3) ir nervu caurules slēgšanas defekti, neietekmējot CNCC stratifikāciju vai migrāciju 13, 14.Papildu peles modeļi ar CNCC sadalīšanas un nervu caurules slēgšanas defektiem palīdzēs noteikt šo divu procesu kopīgo molekulāro bāzi.
Lai CNCC izolētu no neiroepitēlija šūnām, ir jāizšķīdina adhezīvie savienojumi (AJ), kas sastāv no proteīnu kompleksiem, kas cita starpā satur E-kadherīnu, β-katenīnu, α-E-katenīnu un α-aktinīnu, kas saistīts ar aktīna pavedieniem 2 Pārmērīgas ekspresijas pētījumi E-kadherīns nervu krokās uzrādīja CNCC delaminācijas samazināšanos vai aizkavēšanos.Un otrādi, E-kadherīna nomākšana izraisa agrīnu noslāņošanos15, 16.Daudzi faktori, kas mediē EMT CNCC stratifikācijas laikā, ir transkripcijas faktori (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) un ekstracelulārās matricas (ECM) pārveidojošie proteīni, piemēram, matricas metaloproteināzes (MMP), tomēr CNCC ir tiešie citoskeleta AJ regulatori. vēl nav zināms.Ir zināms, ka PI3K-AKT ceļš antagonizē E-kadherīna līmeni, galvenokārt no vēža izpētes17.Nesenie pētījumi liecina, ka uz PDGFα balstītas PI3K-AKT signālu zudums pelēm izraisa galvaskausa un sejas anomālijas, tostarp aukslēju šķeltnes un nervu caurules defektus12.Tomēr saistība starp PI3K-AKT ceļu un AJ stabilitāti pēc CNCC stratifikācijas ir neskaidra.
Mēs iepriekš identificējām SPECC1L kā pirmo mutantu gēnu diviem cilvēkiem ar smagu plaisu, kas stiepjas no mutes līdz acij, kas pazīstama kā slīpā plaisa (ObFC) vai Tessier IV18 plaisa.SPECC1L mutācijas ir identificētas divās vairāku paaudžu ģimenēs ar autosomāli dominējošo Opitz G/BBB sindromu (OMIM #145410), kurā skartajiem indivīdiem bija paaugstināts attālums un lūpu/aukslēju šķeltne19, un vienā ģimenē ar tibi pārmērīgas distances sindromu (OMIM #145420)20. .vairāk nekā puse Opitz G/BBB sindroma gadījumu ir saistīti ar X (OMIM #300000), un tos izraisa mutācijas MID1 gēnā, kas kodē ar mikrotubuliem saistītā šūnu skeleta proteīnu 22.Mēs izvirzām hipotēzi, ka SPECC1L, arī olbaltumviela, kas saistīta ar mikrotubulām un aktīna citoskeletu, var būt starpnieks, kas nepieciešams aktīna citoskeleta pārveidošanai šūnu adhēzijas un migrācijas laikā18.Izmantojot in vitro un in vivo pētījumus, mēs tagad aprakstām SPECC1L kā jaunu AJ stabilitātes regulatoru, izmantojot PI3K-AKT signalizāciju.Šūnu līmenī SPECC1L deficīts izraisīja pan-AKT proteīna līmeņa pazemināšanos un AJ apikālās-bazālās dispersijas palielināšanos, kas tika novērsta, ķīmiski aktivizējot AKT ceļu.In vivo embrijiem ar Specc11 deficītu ir traucēta nervu caurules slēgšana un samazināta CNCC sadalīšana.Tādējādi SPECC1L darbojas ļoti regulētā, uz šūnu adhēziju balstītā signalizācijā, kas nepieciešama normālai CNCC funkcijai sejas morfoģenēzes laikā.
Lai raksturotu SPECC1L lomu šūnu līmenī, mēs izmantojām iepriekš aprakstīto stabilo osteosarkomas šūnu līniju U2OS, kurai trūkst SPECC1L18.Šīm stabilajām U2OS šūnām ar SPECC1L (kd) notriekšanu bija mērens (60–70%) SPECC1L transkriptu un proteīnu līmeņa samazinājums, kā arī migrācijas un aktīna citoskeleta 18 reorganizācijas defekti. Turpretim smaga pārejoša Ir pierādīts, ka SPECC1L izraisa mitotiskus defektus23.Pēc turpmākas raksturošanas mēs atklājām, ka mūsu stabilās SPECC1L-kd šūnas mainīja morfoloģiju ļoti augstā saplūšanas pakāpē (1. attēls).Atsevišķas kontroles šūnas un kd šūnas ar zemu saplūšanu izskatījās līdzīgi (1.A, D attēls).24 stundas pēc saplūšanas kontroles šūnas saglabāja savu kubveida formu (1.B, E att.), savukārt SPECC1L-kd šūnas izstiepās (1.C, F att.).Šo šūnu formas izmaiņu apmērs tika fiksēts, veicot kontroles šūnu un kd šūnu in vivo dzīvu attēlveidošanu (filma 1).Lai noteiktu SPECC1L lomu saplūstošās šūnās, mēs vispirms pārbaudījām tā ekspresiju.Mēs noskaidrojām, ka saplūšanas laikā SPECC1L proteīna līmenis palielinājās (1.G attēls), savukārt SPECC1L transkripta līmenis nepalielinājās (1H attēls).Turklāt, palielinoties šūnu blīvumam, SPECC1L proteīns uzkrājās pie starpšūnu robežām (2. att. A-E), kas pārklājas ar ar membrānu saistītā β-katenīna modeli (2. att. A'-E').Ņemot vērā SPECC1L saistību ar aktīna citoskeletu 18, 23, mēs izvirzījām hipotēzi, ka SPECC1L mijiedarbojas ar adhezīviem savienojumiem, kuru pamatā ir aktīns (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) šūnas izstiepjas augstā satecē (F), salīdzinot ar kontroles U2OS šūnām (AC).Šeit ir parādīti trīs no sešiem laika punktiem (T1, T3, T6), kurus mēs atlasījām dažādiem šūnu blīvumiem.(G) Western blot analīze, kas parāda, ka SPECC1L proteīns ir stabilizēts augstā saplūšanas pakāpē, salīdzinot ar zemu saplūšanas pakāpi kontroles šūnās.SPECC1L Western blot parāda paredzamo 120 kDa joslu un augstākas molekulmasas joslu, iespējams, pēc translācijas modificēta (*).Western blot analīze tika veikta tādos pašos apstākļos zemai un augstai saplūšanai.Attēli, kas parāda SPECC1L zemā un lielā saplūšanā, tika ņemti no tā paša blota.Tas pats blots tika noņemts un atkārtoti pārbaudīts ar β-aktīna antivielu.(H) Kvantitatīvā RT-PCR analīze neuzrādīja būtiskas izmaiņas SPECC1L transkripta līmeņos.Kļūdu joslas attēlo SEM no četriem neatkarīgiem eksperimentiem.
(AE) Mēs izvēlējāmies sešus laika punktus (T1-T6), kas atspoguļo šūnu blīvuma diapazonu, lai normalizētu šūnu formas analīzi un AJ izmaiņas U2OS šūnās ar SPECC1L notriekšanu (kd).Pirmie pieci no šiem laika punktiem ietvēra atsevišķas šūnas (T1), 50–70% mazu šūnu kopu saplūšanu (T2), saplūšanu bez kd šūnu pārveidošanas (T3), kd šūnu pārveidošanu (T4) un 24 stundu izmaiņas.kd (T5) šūnu aizmugurējā formā.SPECC1L proteīns pārsvarā tika izkliedēts citoplazmā pie T1 (A), bet tā uzkrāšanās tika novērota starpšūnu robežās nākamajos laika punktos (B – E, bultiņas).(FJ) β-katenīnam ir līdzīga uzkrāšanās starpšūnu robežās, kas saistītas ar AJ kompleksu.(A'-E') SPECC1L un β-katenīns uzrāda pārklājošu krāsošanu pie šūnu robežām ar augstu šūnu blīvumu (bultiņas).(F'-J') SPECC1L-kd šūnās β-katenīna iekrāsošanās šķiet normāla pie zema šūnu blīvuma (F'-H'), bet izplešas, mainoties šūnu formai (I', J'; bultiņas), norādot, ka AJ ir mainījies.Stieņi = 10 µm.
Pēc tam mēs mēģinājām noteikt SPECC1L deficīta ietekmi uz AJ.Mēs izmantojām vairākus ar AJ saistītus marķierus, tostarp kanoniskos komponentus F-aktīnu, miozīnu IIb, β-katenīnu un E-kadherīnu 24, 25, 26, 27.Aktīna stresa šķiedras palielinājās SPECC1L-kd šūnās, kā aprakstīts iepriekš (3.A, B att.)18.Miozīns IIb, kas saistīts ar aktīna pavedieniem, uzrādīja līdzīgu SPECC1L-kd šūnu pieaugumu in vitro (3. C, D attēls).Ar AJ saistītais β-katenīns saistās ar kadherīnu šūnu membrānā, parādot normālu "šūnveida" ekspresijas modeli kontroles kubocītos (3. E, G att.).Interesanti, ka plakanajos attēlos, izmantojot konfokālo mikroskopiju, β-katenīna (3. E, F) un E-kadherīna (3. G, H att.) krāsošanās uz saplūstošu SPECC1L deficītu šūnu šūnu membrānas parādīja izteiktus pagarinātas krāsošanas modeļus.Šis ar AJ saistītās β-katenīna iekrāsošanās paplašināšanās kd šūnās bija visizteiktākā saplūšanas brīdī, taču šķita, ka tā notika pirms šūnu formas izmaiņām (2. F-J, F'-J' att.).Lai noteiktu šīs paplašinātās AJ krāsošanas fizisko raksturu, mēs pārbaudījām šūnu robežas uz SPECC1L-kd U2OS šūnu apikālās-bazālās virsmas ar transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM) (3I, J attēls).Atšķirībā no kontroles šūnām (3. zīm.), kurām bija atsevišķi elektronu blīvi apgabali, kas norāda uz AJ (bultiņas), kd šūnās (3. zīm.) bija lieli, blakus apgabali ar augstu elektronu blīvumu, kas norāda uz AJ gar apikobazālo plakni..Turklāt šķērsgriezumos mēs novērojām plašas šūnu membrānas krokas kd šūnās (S1A, B att.), kas izskaidro β-katenīna un E-kadherīna krāsošanas joslu paplašināto modeli (3.F, H att.).Lai atbalstītu SPECC1L lomu AJ, β-katenīns tika līdzimunoprecipitēts ar SPECC1L saplūstošu U2OS šūnu lizātos (3K att.).Kopā ar paplašinātu imūno krāsošanu AJ marķieriem, TEM analīze atbilda mūsu hipotēzei, ka SPECC1L deficīts palielina AJ apikālo-bazālo blīvumu un dispersiju.
(AH) Paaugstināta F-aktīna krāsošana kd šūnās 48 stundas pēc saplūšanas (T6; A, B).Mainīta miozīna IIb krāsošana, kas saistīta ar F-aktīnu (C, D).β-katenīna un E-kadherīna membrānas krāsošanas vienmērīgais modelis kontroles šūnās (E, G) tika uzlabots SPECC1L-kd (F, H) šūnās.Stieņi = 10 µm.(I – J) Elektronu mikrogrāfi, kas novēro apikālo-bazālo starpšūnu savienojumu.Kontroles šūnās ir atšķirīgi elektronu blīvi apgabali, kas norāda uz lipīgiem savienojumiem (I, bultiņas).Turpretim viss apikālais-bazālais savienojums SPECC1L-kd šūnās šķita elektronu blīvs (J, bultiņas), kas norāda uz paaugstinātu adhezīvu savienojumu blīvumu un izkliedi.(K) β-katenīns tika vienlaikus imunoprecipitēts ar SPECC1L saplūstošos U2OS šūnu lizātos.Attēls ņemts no vienas vietas, kas attēlo vienu no četriem neatkarīgiem eksperimentiem.
Lai izprastu SPECC1L lomu galvaskausa un sejas morfoģenēzē, mēs izveidojām Specc1l deficīta peles modeli, izmantojot divas neatkarīgas ES slazdu šūnu līnijas DTM096 un RRH048 (BayGenomics, CA), kas pārstāv 1. intronu, un Spec1l transkripti tika notverti pie 15 (1. att.). .4A, S2 attēls).Mānekļa vektora ievietošanas genoma atrašanās vieta tika noteikta ar visa genoma sekvencēšanu un apstiprināta ar PCR (S2 att.).Abi gēnu slazdu modeļi ļāva arī Spec11-lacZ reportieru saplūšanu kadrā pēc uztveršanas.Tāpēc lacZ ekspresija, kas noteikta ar X-gal krāsošanu, tika izmantota kā Specc11 ekspresijas indikators.Abām alēlēm bija līdzīgi lacZ ekspresijas modeļi, un DTM096 gēna slazds 1. intronā uzrādīja spēcīgāku ekspresiju nekā RRH048 15. intronā (nav parādīts).Tomēr Specc1l ir plaši izteikts ar īpaši spēcīgu ekspresiju nervu krokās pie E8.5 (4.B attēls), nervu caurulītē un sejas procesos pie E9.5 un E10.5 (4.C un D attēls) un attīstošās ekstremitātēs. pie E10.5 un acis (4.D attēls).Mēs iepriekš ziņojām, ka SPECC1L ekspresija pirmajā rīkles arkā pie E10.5 bija epitēlijā un pamatā esošajā mezenhīmā18, kas atbilst CNCC ciltsrakstam.Lai pārbaudītu SPECC1L ekspresiju CNCC, mēs veicām E8.5 nervu krokas (4E-J attēls) un E9.5 galvaskausa sekcijas (4K- attēls).Pie E8.5 SPECC1L intensīvi iekrāsoja nervu krokas (4. att. E, H), ieskaitot šūnas, kas iekrāsotas ar NCC marķieriem (4. G. att., J).Pie E9.5, SPECC1L (att. 4K, N) spēcīgi iekrāso migrējošo CNCC kopā ar AP2A (att. 4L, M) vai SOX10 (att. 4O, P).
(A) Shematisks peles Specc11 gēna attēlojums, kas parāda mānekļa vektora ievietošanu ES DTM096 (introns 1) un RRH048 (introns 15) šūnu klonos.(BD) heterozigotu Specc1lDTM096 embriju lacZ krāsošana, kas pārstāv Specc1l ekspresiju no E8.5 līdz E10.5.NE = neiroektoderma, NF = nervu kroka, PA1 = pirmā rīkles arka.(EP) SPECC1L imūnkrāsošana ar NCC marķieriem AP2A un SOX10 E8.5 (NF; EJ) nervu krokās un E9.5 (KP) galvaskausa sekcijās.SPECC1L iekrāsošanās tika plaši novērota neironu krokās E8.5 (E, H; bultu uzgaļi), ieskaitot šūnas, kas marķētas ar AP2A (F, G; bultu uzgaļi) un SOX10 (I, J; bultu uzgaļi).Pie E9.5 SPECC1L spēcīgi iekrāsoja migrējošos CNCC (K, N; bultiņas), kas marķēti ar AP2A (L, M; bultiņas) un SOX10 (O, P; bultiņas).
Krustojums starp heterozigotām Specc1lDTM096/+ un Specc1lRRH048/+ pelēm parāda, ka abas gēnu slazdu alēles nav komplementāras un ka saliktie heterozigoti un embrionālie homozigoti jebkurai gēnu slazda alēlei ir embrionāli letāli (S1 tabula).Mendeļa attiecības liecināja par heterozigotu izdzīvošanas rādītāja samazināšanos dzimšanas brīdī (paredzams 1,34 pret 2,0).Mēs atzīmējām zemu perinatālo mirstību heterozigotu vidū, dažiem bija galvaskausa un sejas anomālijas (S3 att.).Tomēr šo perinatālo galvaskausa un sejas fenotipu zemā iespiešanās dēļ ir grūti izpētīt to pamatā esošos patofizioloģiskos mehānismus.Tāpēc mēs koncentrējāmies uz homozigotu Specc11 mutantu embrionālo letālo fenotipu.
Lielākā daļa salikto heterozigotu vai homozigotu Specc1lDTM096/RRH048 mutantu embriju neattīstījās pēc E9.5–10.5 (5.A–D att.), un nervu caurule neaizvērās no priekšpuses (5.B, D att.) un dažreiz aizvērās aizmugurē (nav parādīts). ..Šis galvaskausa nervu caurules slēgšanas defekts bija saistīts ar lielāko daļu CNCC ar DLX2, kas palika nervu krokās pie E10.5, norādot, ka nav sadalīšanas (attēls 5A'-D').Lai noteiktu, vai tika samazināts arī kopējais CNCC lielums, mēs atzīmējām CNCC līnijas ar GFP mūsu gēnu slazdu līnijās ar Wnt1-Cre un ROSAmTmG.Mēs straumējam šķirotus GFP+ NCC un GFP- (RFP+) ne-NCC no veseliem embrijiem.Pie E9.5 plūsmas šķiroto GFP marķēto CNCC proporcija būtiski nemainījās starp WT un mutantu embrijiem (nav parādīts), norādot uz normālu CNCC specifikāciju.Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka Wnt1-Cre un DLX2 atlikuma iekrāsošanās atklātajās nervu krokās (5B' attēls) bija saistīta ar bojātu CNCC slāņojumu, iespējams, AJ šūnu palielināta blīvuma vai izkliedes dēļ, kā redzams SPECC1L-kd šūnās.Mēs izmantojām NCC marķierus SOX10, AP2A un DLX2, lai apstiprinātu CNCC klātbūtni nervu krokā (5E-R attēls).Pie E8.5 nervu krokas iekrāsošanās visiem trim NCC marķieriem tika novērota WT (5. E, G, I) un Specc1l mutanta (5. F, H, J) sekcijās.Pie E9.5, kamēr NCC marķieri krāsoja migrējošo NCC WT sekcijās (5M, O, Q att.), atlikuma NCC krāsošana tika novērota Specc1l mutantu embriju atklātajās nervu krokās (5.N, P, R att.).Tā kā SOX10 un DLX2 iezīmē migrējošus CNCC, šis rezultāts liecina, ka CNCC ar SPECC1L deficītu sasniedz pēcmigrācijas specifikāciju, bet nespēj migrēt no nervu krokām.
Spec11 deficīts izraisa bojātu nervu caurules slēgšanu, galvaskausa nervu ceku šūnu atslāņošanos un AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrijs, kurā ir migrējošas galvaskausa nervu cekulas šūnas (CNCC), kas marķētas ar Wnt1-Cre (A').Turpretim Specc11 mutantu embrijiem ir atvērtas nervu krokas (B), bultu galviņas un CNCC, kas nav migrējuši (B', bultu galviņas).(C, D') E10.5 WT embriju (C, C') un Specc1l (D, D') CNCC marķiera DLX2 spilgti lauka attēli (C, D') un imūnkrāsošana (C', D').WT E10.5 embrijos DLX2 pozitīvs CNCC kolonizē žaunu arkas (C', bultiņas), savukārt mutantos atklātajās nervu krokās (D', bultiņas) un pirmajās rīkles arkās (D', bultiņas).) ar dažiem krāsojumiem (bultiņām), kas norāda uz sliktu CNCC atslāņošanos un migrāciju.ER) WT un Specc1l mutantu embriju sekcijas E8.5 (E–L) un E9.5 (M–R) stadijā tika marķētas ar NCC marķieriem SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) un DLX2 (I, J, Q, R).Pie E8.5 NCC iekrāsošanās tika novērota savvaļas tipa nervu krokas (NF) un mutantu sekcijās.SOX10 un β-katenīna vienlaicīga iekrāsošana E8.5 WT (K) un mutantā (L) atklāja palielinātu β-katenīna krāsošanu pie šūnu robežām nervu krokās.Pie E9.5 tika novērota migrējošo CNCC (M, O, Q) savvaļas tipa iekrāsošanās, savukārt mutantiem nestratificētie CNCC iekrāsoja atvērtas nervu krokas (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ marķēšanas analīze WT un Specc11DTM096/RRH048 embriju koronālajās sekcijās ar E9.5 mutāciju.Aptuvenā šķērsplakne ir parādīta augšējā labajā stūrī.Mutantu audu sekcijās tika novērota pastiprināta F-aktīna (S, T) un miozīna IIb (U, V) krāsošana.Līdzīgi kā in vitro rezultātiem 3. attēlā, mutantu embrijiem tika novērota pastiprināta membrānas krāsošanās β-katenīnam (W, X) un E-kadherīnam (Y, Z).(AA-BB) Savvaļas embrija daļas elektronu mikrogrāfijā, kas skatās ārpus apikālās-bazālās šūnas robežas, ir redzams atšķirīgs elektronu blīvs apgabals, kas norāda uz adhezīviem savienojumiem (AA, bultiņas).Turpretī Specc11 mutantu embriju sekcijās (BB, bultiņas) viss apikobazālais savienojums ir elektronu blīvs, kas norāda uz palielinātu adhezīvu savienojumu blīvumu un izkliedi.
Lai pārbaudītu mūsu hipotēzi, ka samazināts slāņojums ir saistīts ar izmainītu AJ, mēs pārbaudījām AJ marķējumu Spec1l mutantu embriju atklātajās nervu krokās (5S-Z att.).Mēs novērojām aktīna stresa šķiedru palielināšanos (5. att., T) un vienlaikus palielinātu miozīna IIB iekrāsošanās lokalizāciju uz aktīna šķiedrām (5. att., V).Svarīgi, ka mēs novērojām pastiprinātu β-katenīna (5. W, X att.) un E-kadherīna (5. Y, Z att.) iekrāsošanos starpšūnu robežās.Mēs arī pārbaudījām NCC β-katenīna iekrāsošanos E8.5 embriju nervu krokās (5K, L att.).Šķita, ka β-katenīna iekrāsošanās bija spēcīgāka Spec1l mutantu nervu krokās (5L un K att.), kas liecina, ka ir sākušās AJ izmaiņas.E9.5 embriju galvaskausa sekciju elektronu mikrogrāfijās mēs atkal novērojām pastiprinātu difūzu elektronu blīvu krāsojumu Specc1l mutantu embrijos, salīdzinot ar WT (5AA, BB un S1E-H att.).Kopumā šie rezultāti apstiprina mūsu in vitro rezultātus SPECC1L-kd U2OS šūnās un liecina, ka mūsu mutantu embrijos CNCC noslāņošanās notiek pirms AJ krāsošanas.
Ņemot vērā zināmo antagonistisko saistību starp AKT aktivitāti un E-kadherīna stabilitāti, 17, 28 mēs izvirzījām hipotēzi par PI3K-AKT signālu iesaistīšanos.Turklāt mēs novērojām subepidermālu pūslīšu veidošanos dažos no mūsu mutantu embrijiem, kas izvairījās no letalitātes (<5%) pie E9.5-10.5 un tā vietā apmetās pie aptuveni E13.5 (S3. att.).Subepidermālās pūslīši ir samazinātas PI3K-AKT signālu pazīme, kuras pamatā ir PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) ziņoja, ka uz PDGFRα balstītas PI3K aktivācijas pārtraukšana PdgfraPI3K/PI3K mutantu embrijos izraisa subepidermas pūslīšus, nervu caurules defektus un šķelto aukslēju fenotipus.Patiešām, pan-AKT un aktīvās fosforilētās Ser473-AKT līmenis tika samazināts in vivo Spec1l mutantu audos līdz E9.5 embrija apstādināšanai (6.A-D att.).Fosforilētā Ser473-AKT līmeņa samazināšanās var būt pilnībā saistīta ar pan-AKT līmeņu samazināšanos in vivo (6.E att.) un in vitro (6.F. attēls).In vitro samazinājums tika novērots tikai tad, ja U2OS šūnas bija stipri saplūst ar šūnu formas un AJ blīvuma izmaiņām (6.D attēls).Tādējādi mūsu dati liecina, ka SPECC1L ir jauns pozitīvs PI3K-AKT signālu regulators galvaskausa un sejas morfoģenēzē.
(A–E) E8.5 (A, B) un E9.5 (C, D) galvaskausa sekcijas vai E9.5 lizāti no Specc1l mutantu embrijiem (E), kas parāda aktīvā fosforilētā S473-AKT un pan-AKT proteīna samazināšanos , salīdzinot ar kontroles WT.Western blotēšana tika veikta savvaļas tipa lizātiem un mutantu lizātiem tādos pašos apstākļos.Attēli, kas parādīti SPECC1L, tika ņemti no viena blota.Tas pats blots tika noņemts un atkārtoti pārbaudīts ar anti-pan-ACT un β-aktīna antivielām.Pan-AKT līmenis E8.5 nervu krokās (A, B) un fosforilētā S473-AKT līmenis E9.5 galvaskausa sekcijās tika ievērojami samazināts.(F) Pan-AKT līmenis tika līdzīgi samazināts SPECC1L-kd U2OS šūnu lizātos, kas novāktas lielā saplūšanā.Kļūdu joslas attēlo SEM no trim neatkarīgiem Western blot kvantifikācijām.(GJ) WT embriju sekcijas pie E9.5, kas iekrāsotas attiecīgi ar KI67 un šķelto kaspāzi 3, parādot šūnu proliferāciju (G, G') un nelielu apoptotisko aktivitāti (H, H').Specc11 mutantu embrijiem ir salīdzināma šūnu proliferācija (I), bet ievērojami palielinās šūnu skaits, kurām tiek veikta apoptoze (J).
Pēc tam mēs pārbaudījām proliferācijas un apoptozes marķierus.Mēs nenovērojām nekādas atšķirības E9.5 embriju proliferācijā (6. E, G att., salīdzinot ar I) ar proliferācijas indeksu 82,5% WT mutantiem un 86,5% Specc1l mutantiem, mērot ar KI67 krāsošanu (p <0,56, Fišera). precīzs tests).Tāpat mēs nenovērojām nekādas atšķirības apoptozē, ko mēra, krāsojot šķelto kaspāzi 3 nervu krokās pie E8.5 līdz embrija apstāšanās brīdim (nav parādīts) (nav parādīts).Turpretim apoptoze bija ievērojami palielināta visos E9.5 mutantu embrijos (6. F, H un J att.).Šis kopējais apoptozes pieaugums atbilst samazinātai PI3K-AKT signalizācijai un agrīnai embriju letalitātei 29, 30, 31.
Tālāk, lai apstiprinātu PI3K-AKT signālu cēloņsakarību AJ izmaiņās mūsu kd šūnās, mēs ķīmiski mainījām ceļu kontroles un kd šūnās (7.A-F attēls).Mēs izmantojām kā marķieri saplūstošās SPECC1L-kd šūnās novēroto šūnu formas izmaiņu fenotipu, kuru kvantitatīvi noteicām, izmantojot garākā izmēra (garuma) attiecību pret atbilstošo vertikālo izmēru (platumu).Sagaidāms, ka attiecība ir 1 relatīvi apaļām vai kuboidālām šūnām (7.G attēls).Papildus šūnu formai mēs apstiprinājām arī β-katenīna krāsošanas ietekmi uz AJ (7. A'-F' att.).PI3K-AKT ceļa inhibīcija, izmantojot wortmannīnu, bija pietiekama, lai mainītu šūnu formu kontroles šūnās (7.A, C attēls) un AJ (7.A attēls).PI3K-AKT aktivators SC-79 neietekmēja šūnu formu (7.A, E) vai AJ izplešanos (7A' att.) kontroles šūnās.SPECC1L-kd šūnās turpmāka PI3K-AKT ceļa nomākšana izraisīja pastiprinātu apoptozi (7.B un D att.) un ievērojamu β-katenīna krāsojuma palielināšanos (7.B att.), kas atbilst mūsu smagajiem mutantiem in vivo.Svarīgi, ka PI3K-AKT ceļa aktivizēšana ievērojami uzlaboja šūnu formu (7.B, F attēls) un AJ fenotipus (7.B attēls”).Šūnu formas izmaiņas tika kvantitatīvi noteiktas kā šūnu apaļuma koeficients (CCR) un salīdzinātas pēc nozīmīguma, kā aprakstīts iepriekš (7G. attēls).Patiešām, kontroles šūnās (7.G att., CCR = 1,56) apstrāde ar wortmannīnu bija pietiekama, lai būtiski mainītu šūnu formu (7.G att., CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) tādā mērā, kas ir līdzīgs novērotajam. SPECC1L formātā.-kd šūnas (7G att., CCR = 3,46).SPECC1L-kd šūnu apstrāde ar wortmannīnu (7.G att., CCR = 3,60, niecīga) nebija nozīmīgāka par neapstrādātām kd šūnām (7.G att., CCR = 3,46, niecīga) vai ar wortmannīnu apstrādātām kontroles šūnām (7.G att.)., CCR = 3,46, niecīgs) papildus ietekmē šūnu pagarinājumu (7G, CCR = 3,61, niecīgs).Vissvarīgākais ir tas, ka SC-79 AKT aktivators atjaunoja SPECC1L-kd šūnu iegareno fenotipu (7.G att., CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Šie rezultāti apstiprina, ka SPECC1L regulē PI3K-AKT signālu pārraidi, un liecina, ka mērens SPECC1L samazinājums ietekmē šūnu adhēziju, bet spēcīgs samazinājums izraisa apoptozi (8. att.).
(A–F') kontroles (A, C, E) un SPECC1L-kd (B, D, F) šūnas, kas apstrādātas ar PI3K-AKT ceļa inhibitoru wortmannin (C, D) vai SC-79 aktivatoru (E, F). .Neapstrādātas kontroles šūnas ir kuboīdas (A) ar normālu β-kaķa šūnu krāsojumu (A'), savukārt kd šūnas ir iegarenas (B) ar palielinātu β-kaķa krāsojumu (B').Pēc PI3K-AKT ceļa nomākšanas kontroles šūnas pagarinājās (C) ar β-kaķa izplešanos (C'), savukārt kd šūnās sāka iziet apoptozi (D), līdzīgi kā mūsu ļoti mutētajiem embrijiem un uzrādot ārkārtīgi uzlabotu β-kaķi.krāsošana (D').Pēc PI3K-AKT ceļa aktivizēšanas kontroles šūnas palika kubveida (E) un tām bija normāla β-kaķa (E') krāsošana, savukārt kd šūnām bija ievērojami uzlabota šūnu forma (F) un β-kaķa (F') krāsošana, kas liecina (G) Šūnu formas izmaiņu pakāpe (AF) tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot garākā izmēra (garuma) un atbilstošās vertikālās dimensijas (platuma) šūnu apaļuma attiecību (CCR), izmantojot MetaMorph programmatūru.Neapstrādātas (NT) SPECC1L-kd šūnas (CCR = 3,46) bija ievērojami garākas nekā kontroles šūnas (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Misas PI3K-AKT ceļa inhibīcija kontroles šūnās bija pietiekama, lai izraisītu līdzīgu šūnu formas pagarinājumu (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Līdzīgi, AKT aktivācija ar SC-79 SPECC1L-kd šūnās atjaunoja šūnu pagarinājumu līdz kontroles līmenim (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).SPECC1L-kd šūnu apstrāde ar wortmannīnu izraisīja palielinātu apoptozi, bet ne tālāku šūnu formas izmaiņu palielināšanos (CCR=3,60), salīdzinot ar neapstrādātām kd (CCR=3,46, ns) vai ar wortmannīnu apstrādātām kontroles šūnām (3,61), kas novērotas .ns = nav nozīmes.Parādīti +/- SEM mērījumi 50 šūnām.Statistiskās atšķirības tika aprēķinātas, izmantojot Stjudenta t-testu.
(A) PI3K-AKT ceļa inhibīcijas un aktivizēšanas shematisks attēlojums, kas attiecīgi izraisa AJ izmaiņas un glābšanu.(B) Piedāvātais modelis AKT proteīna stabilizācijai ar SPECC1L.
Premigrācijas CNCC nepieciešama AJ līze, lai atdalītos no priekšējās nervu krokas neiroepitēlija šūnām 1, 15, 32.Pastiprināta AJ komponentu iekrāsošanās un apikālā-bazālā AJ asimetriskā sadalījuma zudums šūnās ar SPECC1L deficītu gan in vitro, gan in vivo, apvienojumā ar SPECC1L fizisko tuvumu β-katenīnam, liecina, ka SPECC1L darbojas, lai pareizi uzturētu AJ lokālo stabilitāti. organizācijas muskuļi.aktīna citoskelets.SPECC1L saistība ar aktīna citoskeletu un β-katenīnu un kondensēto aktīna pavedienu skaita palielināšanās, ja nav SPECC1L, atbilst novērotajam AJ blīvuma pieaugumam.Vēl viena iespēja ir tāda, ka palielināts aktīna šķiedru skaits šūnās ar SPECC1L deficītu izraisa starpšūnu spriedzes izmaiņas.Tā kā šūnu stress ietekmē AJ 33 dinamiku, sprieguma izmaiņas var izraisīt difūzāku AJ 34 .Tātad visas izmaiņas ietekmēs CNCC slāņus.
Wnt1 tiek ekspresēts agrīnās nervu krokās, kas rada nervu cekulas šūnas.Tādējādi Wnt1-cre līnijas izsekošana iezīmē gan pirms, gan migrācijas NCC35.Tomēr Wnt1 iezīmē arī muguras smadzeņu audu klonus, kas iegūti arī no agrīnām nervu krokām 35, 36 , tādēļ ir iespējams, ka mūsu E9.5 mutantu krāsošana Wnt1 marķieriem atklātās nervu krokās nav CNCC.Mūsu pozitīvā krāsošana NCC marķieriem AP2A un SOX10 apstiprināja, ka Specc11 mutantu embriju atklātās nervu krokas patiešām satur CNCC.Turklāt, tā kā AP2A un SOX10 ir agrīnas migrācijas NCC marķieri, pozitīva krāsošana liecināja, ka šīs šūnas ir pēcmigrācijas CNCC, kuras nevar stratificēt ar E9.5.
Mūsu dati liecina, ka AJ molekulāro regulēšanu ar SPECC1L veic PI3K-AKT signalizācija.AKT signalizācija ir samazināta SPECC1L deficīta šūnās un audos.Fantauzzo et al.atbalsta tiešo PI3K-AKT signālu lomu galvaskausa un sejas morfoģenēzē.(2014) parādīja, ka uz PDGFRα balstītas PI3K-AKT signalizācijas aktivizācijas trūkums izraisa aukslēju šķeltnes fenotipu.Mēs arī parādām, ka PI3K-AKT ceļa inhibīcija ir pietiekama, lai mainītu AJ un šūnu formu U2OS šūnās.Saskaņā ar mūsu atklājumiem Cain et al.37 parādīja, ka PI3K α110 apakšvienības pazemināšana endotēlija šūnās izraisa līdzīgu pericelulārā β-katenīna krāsošanas palielināšanos, ko dēvē par “savienojamības indeksa” palielināšanos.Tomēr endotēlija šūnās, kuru aktīna pavedieni jau ir ļoti sakārtoti, PI3K-AKT ceļa nomākšana rada vaļīgu šūnu formu.Turpretim SPECC1L-kd U2OS šūnām bija iegarena šūnu forma.Šī atšķirība var būt specifiska šūnu tipam.Lai gan PI3K-AKT signālu nomākšana pastāvīgi ietekmē aktīna citoskeletu, ietekmi uz šūnu formu nosaka spriedzes izmaiņas, ko izraisa izmaiņas centrālo aktīna šķiedru blīvumā un organizācijā.U2OS šūnās mēs izmantojām tikai šūnu formas izmaiņas kā SPECC1L deficīta AJ izmaiņu un atveseļošanās marķieri.Noslēgumā mēs izvirzām hipotēzi, ka AKT ceļa kavēšana SPECC1L deficīta gadījumā palielina AJ stabilitāti un samazina delamināciju CNCC.
Interesanti, ka pan-AKT līmenis tika samazināts in vitro un in vivo papildus fosforilētajiem 473-AKT līmeņiem, ja nebija SPECC1L, kas liecina par PI3K-AKT signālu regulēšanu AKT proteīna stabilitātes vai apgrozījuma līmenī.SPECC1L un MID1 gēni, kas abi saistīti ar Opitz / GBBB sindromu, kodē proteīnus, kas stabilizē mikrotubulas 18, 22 .Mehānisms, ar kuru SPECC1L un MID1 veicina mikrotubulu stabilizāciju, nav pilnībā izprotams.SPECC1L gadījumā šī stabilizācija ietver pastiprinātu mikrotubulu apakškopas acetilēšanu 18 .Iespējams, ka SPECC1L izmanto līdzīgu mehānismu, lai stabilizētu citus proteīnus, piemēram, AKT.Ir pierādīts, ka lizīna atlieku acetilēšana AKT proteīnā samazina membrānas lokalizāciju un fosforilēšanos38.Turklāt K63 ķēdes ubikvitinācija pie tā paša lizīna atlikuma AKT ir nepieciešama tās membrānas lokalizācijai un aktivizēšanai 39, 40.Starp vairākiem faktoriem, kas mijiedarbojas ar SPECC1L proteīniem, kas identificēti dažādos augstas caurlaidības rauga divu hibrīdu ekrānos, četri - CCDC841, ECM2942, APC un UBE2I43 - ir saistīti ar olbaltumvielu apriti vai stabilitāti, izmantojot ubikvitināciju vai sumoilāciju.SPECC1L var būt iesaistīts AKT lizīna atlikumu pēctranslācijas modifikācijā, ietekmējot AKT stabilitāti.Tomēr vēl ir jānoskaidro SPECC1L kritiskā loma AKT proteīna lokalizācijā un stabilitātē.
Smagi SPECC1L ekspresijas defekti in vivo izraisīja palielinātu AJ marķiera krāsošanu un bojātu CNCC pārklājumu, kā arī palielinātu apoptozi un agrīnu embriju letalitāti.Iepriekšējie ziņojumi ir parādījuši, ka peles mutanti ar paaugstinātu apoptozes līmeni ir saistīti ar nervu caurules defektiem 44, 45, 46, 47 un galvaskausa un sejas defektiem .Ir ierosināts, ka pārmērīga šūnu nāve nervu krokās vai rīkles arkos var izraisīt nepietiekamu šūnu skaitu, kas nepieciešams pareizai morfoģenētiskai kustībai 48, 49, 50.Turpretim mūsu SPECC1L deficīta šūnu līnijas ar mēreni samazinātu SPECC1L ekspresiju parādīja tikai AJ izmaiņas bez pierādījumiem par palielinātu šūnu nāvi.Tomēr PI3K-AKT ceļa ķīmiskā inhibīcija šajās Kd šūnās izraisīja palielinātu apoptozi.Tādējādi mērens SPECC1L ekspresijas vai funkcijas samazinājums nodrošina šūnu izdzīvošanu.Tas atbilst novērojumam, ka reti sastopami Specc11 mutantu embriji, kas izvairās no aresta st.E9.5 — iespējams, samazinātas gēnu uztveršanas efektivitātes dēļ — spēj aizvērt nervu caurules un apstāties vēlākā attīstībā, bieži vien ar galvaskausa un sejas defektiem (S3. att.).Tam atbilst arī reti sastopami heterozigoti Specc1l embriji ar galvaskausa un sejas anomālijām — iespējams, paaugstinātas gēnu uztveršanas efektivitātes dēļ —, kā arī konstatējums zebrazivī, kurā viens no diviem SPECC1L ortologiem (specc1lb) izraisa vēlīnus embriju fenotipus, tostarp embrija zudumu. apakšžokļi un abpusējās spraugas51.Tādējādi cilvēkiem konstatētās heterozigotās SPECC1L funkciju zuduma mutācijas var izraisīt nelielus SPECC1L funkcijas traucējumus galvaskausa un sejas morfoģenēzes laikā, kas ir pietiekami, lai izskaidrotu viņu orofaciālās plaisas.Uz SPECC1L balstīta starpšūnu kontaktu regulēšana var arī ietekmēt palatoģenēzi un rīkles arku saplūšanu.Turpmākie SPECC1L funkcijas pētījumi palīdzēs noskaidrot pagaidu starpšūnu kontaktu lomu CNCC neironu caurules slēgšanas laikā neiroepitēlija šūnu kustībā un galvaskausa un sejas morfoģenēzē.
U2OS osteosarkomas kontrole un SPECC1L-kd šūnas ir aprakstītas iepriekš (Saadi et al., 2011).Antivielas pret SPECC1L ir raksturotas arī iepriekš (Saadi et al., 2011).Anti-β-katenīna antivielas (truši; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (pele; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozīns IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, Sentluisa ) , MO) ), E-kadherīns (1: 1000; Abkam, Kembridža, MA), AP2A (1: 1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1: 1000; 1000; Aviva Systems Biology, Sandjego , Kalifornija), DLX2 (1:1000; Abcam, Kembridža, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; šūnu signalizācijas tehnoloģija, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), šķelto kaspāzi 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) un β-aktīnu (1:2500; Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO ) tika izmantots, kā aprakstīts..Aktīna pavedieni tika iekrāsoti ar Acti-stain rodamīna faloidīnu (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS kontroles šūnas un SPECC1L-kd šūnas tika kultivētas standarta augsta glikozes līmeņa DMEM, kas papildināts ar 10% liellopu augļa serumu (Life Technologies, Carlsbad, CA).AJ izmaiņām 2 x 105 šūnas tika iesētas uz stikla, kas apstrādāts ar 0, 1% cūku želatīnu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), un tika novērotas šūnu formas izmaiņas.Šūnas tika savāktas dažādos norādītajos laika punktos: 4 stundas pēc sēšanas (t = 1), 24 stundas pēc sēšanas (t = 2), saplūšana bez šūnu formas izmaiņām (t = 3), šūnas formas izmaiņas (t = 4) , 24 h pēc šūnas formas maiņas (t = 5) un 48 h pēc šūnas formas maiņas (t = 6) (1., 2., 3. att.).Lai modulētu PI3K-AKT ceļu, šūnas tika kultivētas norādītajās koncentrācijās ar PI3K-AKT inhibitoru wortmannin (TOCRIS Biosciences, Mineapolisa, Minesota) vai SC-79 aktivatoru (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minesota).Barotne, kas satur ķīmiskās vielas, tika mainīta katru dienu.
Kadru pēc kadra ieraksti tika veikti dzīvās kontroles un KD šūnās normālos kultivēšanas apstākļos, un fāzes kontrasta attēli tika savākti ik pēc 10 minūtēm 7 dienas.Attēli tika iegūti, izmantojot datorizētu Leica DM IRB apgriezto mikroskopu, kas aprīkots ar mehānisko skatuvi un 10 × N-PLAN objektīvu, kas savienots ar QImaging Retiga-SRV kameru.Attēlveidošanas laikā šūnu kultūras tika uzturētas 37 ° C temperatūrā mitrā atmosfērā ar 5% CO2.
Divas gēnu lamatas ES šūnu līnijas DTM096 un RRH048 no Reģionālā mutantu peļu resursu centra (UC Davis, CA) tika izmantotas, lai ģenerētu Specc11 deficīta peļu līnijas, apzīmētas ar Specc1lgtDTM096 un Specc1lgtRRH046.Īsumā, 129/REJ ES šūnas tika ievadītas C57BL6 blastocistās.Iegūtās himēriskās peļu tēviņi tika audzētas ar C57BL6 peļu mātītēm, lai identificētu pēcnācējus ar agouti apvalka krāsojumu.Gēnu slazdu vektora ieliktņu klātbūtne tika izmantota heterozigotu identificēšanai.Peles tika turētas uz jaukta fona 129/REJ; C57BL6.Ģenētiskā lamatas vektora ievietošanas vietas atrašanās vieta tika apstiprināta ar RT-PCR, genoma sekvencēšanu un ģenētisko komplementāciju (1. papildu attēls).Lai izsekotu dubulto heterozigotu Specc1lGT peļu CNCC izcelsmi, tika krustotas ROSAmTmG (#007576) un Wnt1-Cre (#003829) peles (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), lai iegūtu ROSAmTmG un Wnt1-Cre mutāciju Speccosl embrijs.Visi eksperimenti ar pelēm tika veikti saskaņā ar protokoliem, ko apstiprinājusi Kanzasas Universitātes Medicīnas centra Institucionālā dzīvnieku aprūpes un lietošanas komiteja.
Embriji tika fiksēti (1% formaldehīds, 0,2% glutaraldehīds, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) 60 minūtes istabas temperatūrā.Pēc fiksācijas X-gal krāsošanas šķīdumā (5 mM kālija fericianīds, 5 mM kālija ferocianīds, 2 mM MgCl2, 0,01% nātrija deoksiholāts, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Traipu veidošanās tika veikta 37°C temperatūrā. .°C 1-6 stundu laikā.Embriji tika pēc tam fiksēti 4% PFA un vizualizēti.
Western blotēšanai šūnas tika lizētas pasīvā līzes buferšķīdumā (Promega, Fitchburg, WI), kas papildināts ar HALT proteāzes inhibitoru maisījumu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lizāti tika apstrādāti uz 12% poliakrilamīda Mini-PROTEAN TGX gataviem gēliem (Bio-Rad, Hercules, CA) un pārnesti uz Immobilon PVDF membrānām (EMD Millipore, Billerica, MA).Membrānas tika bloķētas 5% pienā PBS, kas satur 0, 1% Tween.Antivielas inkubēja nakti 4 ° C temperatūrā vai vienu stundu istabas temperatūrā.Signāla ģenerēšanai tika izmantots Femto SuperSignal West ECL reaģents (Thermo Scientific, Waltham, MA).Imūnkrāsošanai embriji tika fiksēti uz nakti 4% PFA / PBS un uzglabāti kriokonservēti.Audu kriosekcijas tika bloķētas PBS, kas satur 1% normālu kazas serumu (Thermo Scientific, Waltham, MA) un 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO), un pēc tam inkubācijas laikā inkubēja 4 °C temperatūrā inkubatorā. nakts.ar anti-antivielu un fluorescējošu sekundāro antivielu (1:1000) 1 stundu 4°C temperatūrā.Krāsotas sekcijas tika ievietotas ProLong zelta barotnē (Thermo Scientific, Waltham MA), un plakani attēli tika iegūti, izmantojot Leica TCS SPE konfokālo mikroskopu.Katra imūnkrāsošana tika veikta kā trīs neatkarīgi eksperimenti ar vismaz divu mutantu embriju cirosekcijām.Tiek parādīts reprezentatīvs eksperiments.
Šūnas tika inkubētas modificētā RIPA buferšķīdumā (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerīns, 2 mM EDTA un HALT proteāzes inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Īsumā, lizāti tika iepriekš attīrīti ar proteīna G magnētiskajām lodītēm (Life Technologies, Carlsbad, CA) un pēc tam inkubēti nakti 4 ° C temperatūrā ar anti-SPECC1L vai IgG proteīna G proteīna lodītēm, tika izmantotas, lai ekstrahētu SPECC1L, un Western blotēšana tika veikta, izmantojot antivielu. Iepriekš aprakstītā -β-katenīna antiviela Parādītie kop-IP eksperimenti ir reprezentatīvi četriem neatkarīgiem eksperimentiem.
Fiksētas kultivētas šūnas vai peles embriju audi tika piegādāti Kanzasas Universitātes Medicīnas centra elektronu mikroskopijas centram.Īsumā, paraugi tika iegulti EMbed 812 sveķos (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizēti nakti 60 ° C temperatūrā un sadalīti pie 80 nm, izmantojot Leica UC7 ultramikrotomu, kas aprīkots ar dimanta asmeni.Sekcijas tika vizualizētas, izmantojot JEOL JEM-1400 transmisijas elektronu mikroskopu, kas aprīkots ar 100 kV Lab6 lielgabalu.
Kā citēt šo rakstu: Wilson, NR et al.SPECC1L deficīts palielina savienoto savienojumu stabilitāti un samazina galvaskausa nervu kores šūnu atslāņošanos.zinātne.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Nervu cekulas indukcija un diferenciācija.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Galvaskausa nervu ceku šūnas kustībā: to loma galvaskausa un sejas attīstībā.American Journal of Medical Genetics.A daļa, 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: tās izaugsme un attīstība 20 gadu laikā.Pediatrs.patoloģija.laboratorija.medicīna.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU un Noten MM Izrāviens orofaciālo plaisu ģenētikā.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. un Riley, FM Molekulārie mehānismi galvaskausa nervu cekulas šūnu migrācijai un modelēšanai galvaskausa un sejas attīstības laikā.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH un Murray, JK Lūpu un aukslēju šķeltne: ģenētiskās un vides ietekmes izpratne.dabisks komentārs.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Ādas, ekstremitāšu un galvaskausa-sejas reģiona patoloģiska morfoģenēze pelēm ar interferonu regulējošā faktora-6 (Irf6) deficītu.Nacionālā Dženeta.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominējošās mutācijas GRHL3 izraisa van der Waord sindromu un traucē mutes peridermas attīstību.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Hariss, MJ un Jurilofs, DM Atjauniniet to peles mutantu sarakstu, kuriem ir nervu caurules slēgšanas defekti, un virzieties uz pilnīgu ģenētisko izpratni par nervu caurules slēgšanu.Iedzimtu defektu izmeklēšana.A daļa, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediētā PDGFRalpha signalizācija regulē izdzīvošanu un proliferāciju skeleta attīstībā, izmantojot no p53 atkarīgu intracelulāro ceļu.Gēnu izstrāde 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND un Murdoch, JN Disheveled: Konverģences paplašināšanās saistība ar nervu caurules slēgšanu.Tendences neiroloģijā.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).